Дискриминация и характеристика гетеросекулярных групп населения с использованием методов количественной визуализации

Общая цель данной методологии заключается в количественной оценке динамических фенотипических реакций гетероклеточных популяций на пертубации при одновременном различении субпопуляций. Большинство физиологических взаимодействий происходит в присутствии нескольких типов клеток. Этот метод может помочь клеточным биологам оценить, как гетерогенные клетки реагируют на одинаковое давление окружающей среды и как разные клетки влияют друг на друга.

Этот метод имеет несколько преимуществ, он различает несколько типов клеток, позволяет проводить одновременный анализ субпопуляций, включая показатели рождаемости и смертности, а также морфологическую динамику. Хотя этот протокол может быть использован для изучения многих биологических процессов, мы продемонстрируем рабочий процесс с использованием опухолевых клеток H3255 и CCD19LU клеток фибробластов, обработанных химиотерапевтическим препаратом эрлотинибом. Для начала, после приготовления клеточных суспензий в пробирках согласно текстовому протоколу, переверните пробирки, чтобы смешать клетки в растворе для стандартизации посева.

Затем пипеткой нанесите по 10 микролитров суспензии каждой клетки в микроцентрифужную пробирку, и добавьте 10 микролитров трипанового синего. Нанесите пипеткой 10 микролитров раствора в предметное стекло для подсчета клеток и вставьте предметное стекло в автоматический счетчик клеток. Повторите подсчет ячеек не менее трех раз или до тех пор, пока полученные подсчеты не станут согласованными.

С помощью многоканальной пипетки засейте в общей сложности 1500 клеток в 100 микролитров RPMI в лунки 96-луночного планшета. Нанесите на каждую клеточную подвеску в трех экземплярах с идентичными настройками пластин для каждого временного момента. Инкубируйте клетки на ночь.

Добавьте ДМСО в порошок Эрлотиниба, чтобы получить 10 миллимолярный стоковый раствор Эрлотиниба. Затем с помощью клеточной питательной среды разбавьте препарат до двукратной максимальной конечной концентрации 10 микромоляров. Последовательно разбавляйте препарат четыре раза в соотношении 1:10, чтобы получить в общей сложности пять концентраций препарата и отсутствие контроля препарата.

Пипеткой внесите 100 микролитров раствора лекарственного средства в соответствующие лунки 96-луночного планшета клеток для получения конечной концентрации препарата 1х, разведенных в среде. Затем для окрашивания клеток для классификации на основе флуоресценции приготовьте пять микрограммов на миллилитр ядерного красителя и пять микромолярных красителей мертвых клеток в PBS. Для классификации на основе морфологии приготовьте пять микрограммов на миллилитр ядерного красителя, пятимикролярное окрашивание мертвых клеток и пятое микромолярное окрашивание клеток в PBS.

В каждую лунку добавьте по 20 микролитров раствора красителя. Затем инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в защищенном от света месте в течение 30 минут. Для получения изображений используйте 70% этанол, чтобы протереть нижнюю часть пластины и поместить пластину в камеру визуализации.

На вкладке «Настройка» в разделе «Выбор канала» нажмите кнопку с плюсом, чтобы добавить соответствующие каналы к изображению. В разделе «Выбор компоновки» задайте стек тестовых изображений z каждые два микрона, начиная с нуля микрон и заканчивая 20 микронами, чтобы определить плоскость фокусировки. Нажмите «Снимок» под каждым каналом, чтобы оценить интенсивность и оптимизировать время воздействия.

При необходимости введите большие или меньшие значения в поле time. Ядра в клетках должны быть в фокусе, чтобы обеспечить точность последующего анализа. На схеме пластины выделите соответствующие скважины.

Затем на схеме скважин выделите 25 полей, которые должны быть изображены аналогичным образом. В разделе «Запустить эксперимент» определите номерной знак в имени номерного знака, затем нажмите кнопку «Пуск», чтобы запустить протокол получения изображений с целью 10x для создания изображений TIFF в оттенках серого в выбранных каналах. После установки программного обеспечения с открытым исходным кодом, CellProfiler и анализа CellProfiler, откройте CellProfiler, нажмите Файл, Импорт, Конвейер из файла и выберите соответствующий файл.

Выберите конвейер классификации на основе флуоресценции, чтобы классифицировать клетки как H3255 или CCD19LU на основе интенсивности EGFP и вычислить морфологические особенности. Нажмите «Просмотреть настройки вывода», затем выберите расположение файлов изображений для анализа и место назначения извлеченных данных. Перед проведением анализа протокол должен быть протестирован в тестовом режиме для проверки значений параметров.

Важно, чтобы ядерная и клеточная сегментация была точной. Этот протокол был разработан для идентификации клеток с различным окрашиванием ядер, чтобы гарантировать, что значение пикселя, на которое ядра расширяются, достаточно велико для маскировки ядер с самым высоким окрашиванием ДНК, но достаточно мало, чтобы не маскировать окружающие ядра. Чтобы классифицировать популяции на основе флуоресценции, сначала измените диапазон интенсивности GFP, затем измерьте интенсивность GFP каждого идентифицированного ядра и классифицируйте объекты на основе заданного пользователем порога.

Затем нажмите «Анализ изображений», чтобы начать анализ. Когда анализ будет завершен, перейдите в папку вывода по умолчанию для просмотра рассчитанных данных. Для классификации на основе морфологии запустите соответствующий протокол в профилировщике клеток для генерации признаков морфологии всей клетки.

Откройте программу Cell Profiler Analysis, выберите файл свойств базы данных, созданный в Cell Profiler, и нажмите кнопку «Открыть». Перейдите на вкладку Классификатор в левом верхнем углу экрана. Чтобы вызвать случайные изображения клеток из эксперимента, нажмите fetch, изображения появятся в неклассифицированном окне.

Вручную классифицируйте ячейки как положительные или отрицательные, которые в данном случае представляют H3255 или CCD19LU, выбрав и перетащив ячейки в соответствующую ячейку. После классификации по крайней мере 50 ячеек для каждой субпопуляции нажмите кнопку Обучение классификатора, а затем нажмите кнопку Проверить ход выполнения. Наконец, нажмите кнопку «Оценить все», чтобы создать таблицу с количеством ячеек для каждой субпопуляции.

В гетероцеллюлярной холодной культуре опухолевых и CCD19LU клеток фибробластов H3255 ядра были идентифицированы и сегментированы на основе окрашивания ДНК. Клеточные популяции были классифицированы либо с помощью искусственно вызванной флуоресценции, либо с помощью алгоритма машинного обучения для идентификации типов клеток на основе морфологических различий. Существует высокая степень соответствия между методологиями, основанными на флуоресценции и морфологии.

Эти два метода классификации были независимо друг от друга применены к одним и тем же изображениям и совпали в 97,4% и 92,5% в отношении необработанных и обработанных популяций соответственно. Здесь были исследованы изменения в морфологии клеток и ответе на лечение эрлотинибом. После трех дней лечения препаратом у клеток H3255 наблюдалось уменьшение площади ядер и увеличение клеточной площади.

Возможно, это было связано с гибелью клеток. Чтобы проверить, оказывает ли эрлотиниб цитотоксическое или цитостатическое действие на клетки, мертвые клетки были идентифицированы на основе окрашивания йодидом пропидия. Наблюдалось как цитотоксическое, так и цитостатическое действие Эрлотиниба на клетки H3255, с увеличением числа смертей и уменьшением числа рождений после лечения препаратом.

После освоения этой техники ее можно выполнить за два часа подряд, если она выполнена правильно. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как интерференция РА или CRISPR, для решения дополнительных вопросов, исследующих функциональную геномику. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии рака к изучению влияния стромальных клеток на прогрессирование опухоли при нескольких типах рака.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как изучать гетероклеточные реакции на стимулы окружающей среды, в частности, как анализировать данные визуализации на основе микроскопии с высокой пропускной способностью.