Ломтик метод для анализа обучения индуцированная пластичности
11 ноября 2017 г.
Ломтик метод является эффективным методом для анализа обучения индуцированная изменения внутренние свойства и пластичность возбуждающим или тормозящее синапсы.
Привет, меня зовут Дай Мицусима. Здесь мы покажем вам, как делать срезы мозга у обученных животных, сравнивая данные патч-зажимов у необученных животных. Мы можем проанализировать синаптическую пластичность, вызванную обучением.
Привет, меня зовут Хироюки Кида. В этом эксперименте мы исследовали нейромеханизм работы двигателя с помощью теста с роторным стержнем. Тест стержня ротора широко используется для оценки моторных способностей грызунов.
Преимущество этого метода заключается в том, что мы можем изменять уровень обнаружения во время теста, увеличивая скорость вращения устройства. Испытание стержня ротора. Перед началом работы двигателя стержень ротора должен быть установлен в режим разгона от 4 до 40 об/мин в течение 300 секунд.
Крыс заставляли выполнять десять попыток для каждого теста. Во временном интервале между попытками было 30 секунд. Во время первой тренировки крысы обычно падают с удилища даже на небольших скоростях и иногда идут не в том направлении.
Однако после повторных тренировок крыса может ходить с более высокой скоростью. Измеряя задержку на стержне, мы можем оценить эффективность обучения крысы навыку. Здесь мы можем ознакомиться с результатами испытания стержня ротора.
Как показано на этом рисунке, двух дней тренировок достаточно, чтобы приобрести двигательный навык. По сравнению с задержкой в первом испытании, апостериорный анализ показал значительное улучшение в финальном испытании в дни обучения. Измеряя задержку на стержне, мы можем оценить эффективность обучения крысы навыку.
Далее мы покажем вам тест на ингибиторное избегание. Этот тест полезен для анализа контекстуальной успеваемости. Аппарат ингибиторного избегания состоит из светлой и темной сторон, разделенных люком.
Во время тренировки крыс размещают в освещенной зоне и дают им короткое время, чтобы акклиматизироваться к окружающей среде. Как только дверь открывается, крысы могут свободно входить в затемненную область по своему желанию. При входе в затемненную зону дверь закрывается, и крыс получают легкий удар электрическим током в течение двух секунд.
После возвращения в клетки на 30 минут по окончании испытания крыс снова помещают в освещенную зону аппарата. Через тридцать минут после шока обученные крысы последовательно демонстрировали более длительную задержку перед входом в темную зону. Здесь мы можем увидеть результаты теста на избегание ингибиторов.
После поражения электрическим током крысы научились избегать затемненного участка и держаться на освещенной стороне, которую они обычно не предпочли бы. Эта тенденция избегать затемненной стороны указывает на приобретение контекстуальных воспоминаний. Срезы мозга после тренировки.
Перед надрезом охлаждаем все ножницы, гемостатики и стаканы колотым льдом. Здесь вы можете ознакомиться с нашей подготовкой к вскрытию. Диссекция головного мозга должна быть выполнена как можно быстрее.
После этого под глубоким наркозом крысу помещают в неглубокий лоток с колотым льдом и делают разрез для вскрытия брюшной полости. После разреза диафрагмы делается еще один боковой разрез. Чтобы открыть грудную полость, реберный хрящ должен быть закрыт с помощью гемостата.
После обнажения сердца игла из нержавеющей стали 18-го калибра вводится в заднюю часть левого желудочка. Кончик иглы, должен быть виден через стенку аорты. После разрезания правой ушной раковины запускается перфузия.
Убедитесь, что игла и шприц предварительно заполнены газообразным ледяным буфером для препарирования. Любые пузырьки воздуха также должны быть удалены перед перфузией. Во-первых, разрез в задней части черепа.
Затем сделайте боковой надрез, а затем центральный разрез, чтобы обнажить мозг. После вскрытия мозг должен быть помещен в пузырящийся ледяной буфер на пять минут. Прежде чем приступить к вскрытию, фильтровальную бумагу следует намочить с помощью ледяного буфера.
Затем мозг помещают на ледяную сцену из нержавеющей стали. Угол режущей ступени имеет решающее значение для обеспечения правильного угла резки для среза мозга. Неправильный угол потенциально может разрезать целевые пирамидальные нейроны.
После обрезки одну каплю суперклея следует нанести на ступень вибратона. Чтобы обеспечить плотное сцепление, излишки буфера для рассечения следует удалить с помощью листа фильтровальной бумаги. С помощью вибратона можно сделать тонкие срезы мозга, которые поддерживаются в пузырящемся ледяном буфере.
Нашей целевой областью является первичная моторная кора. Целевую область мозга можно обрезать с помощью ножниц с радужной оболочкой. Интерфейсная камера может быть выполнена с использованием пластикового пищевого контейнера.
Крышка интерфейсной камеры необходима для удержания газа. Срезы наблюдаются с помощью инфракрасного микроскопа. Здесь мы можем увидеть пример нейронов слоя 2/3 в первичной моторной коре.
Патч-записывающие пипетки заполняются соответствующим внутриклеточным раствором. Решение для анализа токовых клещей отличается от решения для анализа электрических клещей. Репрезентативные результаты.
Современный метод зажима полезен для анализа свойств собственных ячеек. После тренировки с роторным стержнем мы смогли получить данные о текущем зажиме от нейронов слоя 2/3 в первичной моторной коре. На панели A показаны типичные трассы, индуцированные инжекциями тока.
На панели B указана связь между инжектируемым током и числом скачков. Однодневные крысы вызывали меньше всплесков, в то время как двухдневные крысы вызывали гораздо больше всплесков, чем необученные крысы. Как видно на нижних панелях, однодневные обученные крысы демонстрировали более низкий потенциал покоя, более высокий порог спайка и более глубокую постгиперполяризацию.
Крысы, дрессированные в течение двух дней, продемонстрировали более высокий потенциал покоя и устойчивость к мембранам. Метод зажима напряжения полезен для анализа синаптической пластичности, вызванной обучением. Здесь мы можем увидеть данные от нейронов CA1 после контекстуального обучения.
Мы получили миниатюрные постсинаптические токи из нейронов CA1, индуцированные одиночными везикулами глутамата или ГАМК. На панелях А и В видны репрезентативные следы миниатюрного постсинаптического тока. В присутствии тетродотоксина миниатюрные EPSC при напряжении минус 16 милливольт и миниатюрные IPSC при 0 милливольтах измерялись последовательно в одних и тех же нейронах.
На панели C показаны двумерные графики миниатюрных амплитуд EPSC и миниатюрных IPSC у необученных, обученных, непарных и проходных крыс. На панели D показаны графики для миниатюрных частот. Как видно на нижних панелях, контекстуальные тренинги значительно усиливали как возбуждающие, так и тормозные синапсы, способствуя разнообразию синаптических входов в нейроны.
Таким образом, метод токового зажима полезен для анализа изменений свойств клеток, вызванных обучением. Кроме того, метод потенциал-зажима является мощным инструментом для анализа пластичности, вызванной обучением, в возбуждающих и тормозных синапсах. С подробными результатами этих анализов можно ознакомиться в следующих публикациях.
Обзор
В данной статье демонстрируется метод анализа изменений свойств синапсе и пластичности, вызванных обучением, с помощью техники слайс патч-кламп. Исследование сосредоточено на моторной когниции и контекстном обучении у обученных крыс.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Электрофизиология
- Анализ поведения
Предпосылки
- Техника слайс патч-кламп имеет ключевое значение для изучения функции синапсе.
- Моторную когницию можно оценить с помощью теста на роторной палочке.
- Контекстное обучение оценивается с помощью тестов на ингибиторное избегание.
- Понимание синаптической пластичности важно для понимания механизмов обучения.
Цель исследования
- Анализ пластичности синапсе, вызванной обучением, у крыс.
- Сравнение свойств синапсе между обученными и необученными животными.
- Исследование нейромеханизма моторного бега.
Использованные методы
- Тест на роторной палочке для оценки приобретения моторных навыков.
- Тест на ингибиторное избегание для анализа контекстной памяти.
- Подготовка мозговых слайсов и записи патч-кламп.
- Техники токового и напряженного кламп для анализа синаптической активности.
Основные результаты
- Два дня тренировки значительно улучшили моторные навыки.
- Обученные крысы продемонстрировали улучшенные свойства синапсе по сравнению с необученными крысами.
- Данные токового кламп показали увеличенную спайковую активность у обученных крыс.
- Результаты напряженного кламп указывали на изменения в миниатюрных постсинаптических токах.
Выводы
- Исследование подтверждает эффективность метода слайс патч-кламп.
- Тренировка улучшает как моторные навыки, так и синаптическую пластичность.
- Эти результаты способствуют пониманию нейронной основы обучения.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
The slice patch clamp technique enables direct measurement of learning-induced changes in neuronal excitability and synaptic strength, providing mechanistic insights into neural circuit adaptation. This approach supports target validation in neuroscience drug discovery by linking behavioral phenotypes to cellular and synaptic phenotypes. It enhances predictive confidence in early discovery by de-risking hypotheses about compound effects on plasticity-related pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring changes in resting membrane potential, spike threshold, and membrane resistance in trained versus untrained neurons.
- Scientific Value: Clarifies pathway involvement by demonstrating learning-induced increases in spiking activity in layer II/III pyramidal neurons of motor cortex.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by quantifying synaptic plasticity at both excitatory and inhibitory synapses in hippocampal CA1 neurons following contextual learning.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (acute brain slices) for downstream assessment of compound effects on intrinsic and synaptic neuronal properties.
- Scientific Value: Enables assay standardization through sequential recording of mEPSCs and mIPSCs from the same neuron, reducing variability in synaptic strength measurements.
- Scientific Value: Provides quantitative outputs (amplitude, frequency of postsynaptic currents) that support reliable compound evaluation in phenotypic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease-relevant system utility by modeling learning-induced plasticity in motor cortex and hippocampus, regions relevant to cognitive and motor disorders.
- Scientific Value: Ensures translational continuity from behavioral training (rotor rod, inhibitory avoidance) to cellular readouts, supporting mechanism-based target validation.
- Scientific Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by identifying compounds that normalize learning-induced hyperactivity or synaptic imbalance.
Pipeline & Workflow Integration
The technique integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, particularly for targets modulating neuronal excitability or synaptic transmission.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by comparing neuronal properties between behaviorally trained and naive animals to validate target engagement.
- Screening: Delivers assay readiness via stable, reproducible whole-cell patch clamp recordings in acute slices, enabling dose-response analysis of test compounds.
- Analytics: Generates key readouts including spike count, resting potential, membrane resistance, and mEPSC/mIPSC amplitude/frequency to quantify neuronal and synaptic responses.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking learning-induced synaptic changes to potential biomarkers of circuit dysfunction in neuropsychiatric disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable electrophysiology platform applicable across brain regions (e.g., sensory cortex, amygdala) and learning paradigms, maximizing asset utilization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in how learning alters neuronal and synaptic function.
- Operational Value: Promotes standardization through defined slice preparation, perfusion, and recording protocols that enhance reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct electrophysiological evidence of target-mediated effects on plasticity pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds that reverse pathological plasticity without disrupting baseline function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, brain slicing, and behavioral neuroscience to ensure data quality and interpretation.
- Dependent on instrumentation including vibratomes, patch clamp amplifiers, perfusion systems, and infrared-DIC microscopy for successful slice preparation and recording.
- Necessitates cross-team standardization between behavior, histology, and electrophysiology groups to align training paradigms with slice timing and region targeting.
- Involves adaptation considerations when applying the technique to different brain regions or neuron types, such as adjusting slice orientation or intracellular solution composition.
- Limited by the acute nature of brain slices, which restricts longitudinal studies but preserves native circuitry for ex vivo mechanistic analysis.
