Ломтик метод для анализа обучения индуцированная пластичности
11 ноября 2017 г.
Ломтик метод является эффективным методом для анализа обучения индуцированная изменения внутренние свойства и пластичность возбуждающим или тормозящее синапсы.
Здравствуйте, меня зовут Дай Мицусима. Здесь мы продемонстрируем вам, как готовить срезы мозга обученных животных, сравнивая данные патч-клампа с данными от необученных животных. Это позволит нам проанализировать синаптическую пластичность, вызванную обучением.
Здравствуйте, меня зовут Хироюки Кида. В данном эксперименте мы исследовали нейромеханизмы локомоторной активности с помощью теста «вращающийся стержень» (Rotor rod test). Тест «вращающийся стержень» широко применяется для оценки моторного познания у грызунов.
Преимущество данного метода заключается в том, что в ходе испытания можно изменять уровень сложности, увеличивая скорость вращения. Тест на роторном стержне. Перед выполнением двигательной задачи аппарат с роторным стержнем должен быть настроен на режим ускорения от 4 до 40 rpms в течение 300 секунд.
Крысам предлагалось выполнить по десять попыток для каждого теста. Интервал времени между попытками составлял 30 секунд. Во время первого тренировочного сеанса крысы обычно падают с ротора даже при низких скоростях, а иногда идут в противоположном направлении.
Однако после повторного обучения крыса может передвигаться с более высокой скоростью. Измеряя латентный период удержания на стержне, мы можем оценить эффективность освоения навыка крысой. Здесь представлены результаты теста на роторном стержне.
Как показано на этом рисунке, двух дней обучения достаточно для освоения моторного навыка. По сравнению с латентным периодом при первой попытке, апостериорный анализ показал значительное улучшение в последней попытке в дни обучения. Измеряя латентный период на стержне, мы можем оценить эффективность обучения крысы данному навыку.
Далее мы продемонстрируем тест на тормозное избегание. Этот тест полезен для анализа показателей контекстуального обучения. Установка для теста на тормозное избегание состоит из светлой и темной сторон, разделенных люком.
Во время тренировочной сессии крыс помещают в освещенную зону и дают короткое время для акклиматизации к окружающей среде. После открытия двери крысы могут по своему желанию войти в затемненную зону. При входе в затемненную зону дверь закрывается, и крысы получают слабый удар электрическим током в течение двух секунд.
По завершении испытания крыс возвращают в клетки на 30 минут, после чего их снова помещают в освещенную зону аппарата. Через 30 минут после воздействия тока у обученных крыс последовательно наблюдалась более длительная латентность перед входом в темную зону. Здесь представлены результаты теста на тормозное избегание.
После электрического шока крысы научились избегать затемненной области и оставаться на освещенной стороне, которой они обычно не отдавали предпочтения. Эта тенденция избегать темной стороны указывает на формирование контекстуальной памяти. Срезы мозга после обучения.
Перед началом разреза мы охлаждаем все ножницы, гемостаты и стаканы с помощью дробленого льда. Здесь представлен наш набор для препарирования. Диссекцию мозга следует проводить как можно быстрее.
После глубокой анестезии крысу помещают в неглубокий лоток с дробленым льдом и делают разрез для вскрытия брюшной полости. После разреза диафрагмы делают дополнительный латеральный разрез. Для вскрытия грудной полости реберный хрящ следует зажать гемостатом.
После обнажения сердца в заднюю часть левого желудочка вводится стальная игла 18-го калибра. Кончик иглы должен быть виден сквозь стенку аорты. После рассечения правого ушка начинается перфузия.
Убедитесь, что игла и шприц предварительно заполнены охлажденным до температуры льда насыщенным кислородом буфером для диссекции. Перед началом перфузии также необходимо удалить все пузырьки воздуха. Сначала сделайте разрез в задней части черепа.
Затем сделайте боковой разрез, после чего выполните центральный разрез, чтобы обнажить мозг. После выделения мозг следует поместить в аэрируемый ледяной буфер на пять минут. Перед началом диссекции фильтровальную бумагу необходимо увлажнить ледяным буфером.
Затем мозг помещают на охлажденный льдом столик из нержавеющей стали. Угол наклона столика имеет решающее значение для обеспечения правильного угла среза ткани мозга. Неправильный угол может привести к повреждению целевых пирамидных нейронов.
После обрезки на предметный столик вибратома следует нанести одну каплю суперклея. Для обеспечения плотного прилегания излишки буфера для диссекции необходимо удалить с помощью кусочка фильтровальной бумаги. С помощью вибратома можно изготовить тонкие срезы мозга, поддерживая их в перемешиваемом ледяном буфере.
Целевой областью является первичная моторная кора. Целевую область мозга можно отсечь с помощью ножниц Ирис. Интерфейсную камеру можно изготовить из пластикового пищевого контейнера.
Крышка интерфейсной камеры необходима для удержания газа. Срезы наблюдают с помощью инфракрасного DIC-микроскопа. Здесь представлен пример нейронов слоев 2/3 в первичной моторной коре.
Пипетки для локальной фиксации заполняют соответствующим внутриклеточным раствором. Раствор для анализа в режиме фиксации тока отличается от раствора для анализа в режиме фиксации потенциала. Репрезентативные результаты.
Метод фиксации тока (current clamp) полезен для анализа собственных свойств клетки. После обучения на вращающемся стержне (Rotor rod) нам удалось получить данные фиксации тока от нейронов слоев 2/3 первичной моторной коры. На панели A представлены типичные кривые, вызванные инъекциями тока.
На панели B показана зависимость количества спайков от величины вводимого тока. У крыс с однодневным обучением индуцировалось меньше спайков, в то время как у крыс с двухдневным обучением их количество было значительно выше, чем у необученных крыс. Как видно из нижних панелей, у крыс с однодневным обучением наблюдался более низкий потенциал покоя, более высокий порог возникновения спайка и более глубокая послегиперполяризация.
У крыс, прошедших двухдневное обучение, наблюдался более высокий потенциал покоя и мембранное сопротивление. Метод фиксации потенциала (voltage clamp) эффективен для анализа синаптической пластичности, вызванной обучением. Здесь представлены данные нейронов области CA1 после контекстного обучения.
Мы регистрировали миниатюрные постсинаптические токи в нейронах области CA1, индуцированные отдельными везикулами глутамата или ГАМК. На панелях A и B представлены репрезентативные записи миниатюрных постсинаптических токов. В присутствии тетродотоксина в одних и тех же нейронах последовательно измеряли миниатюрные ВПСП при -16 mV и миниатюрные ТПСП при 0 mV.
На панели C представлены двухмерные графики амплитуд миниатюрных ЭПСП (mEPSC) и миниатюрных ИПСП (mIPSC) у необученных, обученных, неспаренных и прошедших процедуру «прохода» крыс. На панели D представлены графики для соответствующих миниатюрных частот. Как видно из нижних панелей, контекстуальное обучение значительно усилило как возбуждающие, так и тормозные синапсы, что способствовало разнообразию синаптических входов в нейроны.
Подводя итог, метод фиксации тока (current-clamp) полезен для анализа изменений свойств клеток, вызванных обучением. В то же время метод фиксации потенциала (voltage-clamp) является мощным инструментом для анализа пластичности возбуждающих и тормозных синапсов, индуцированной обучением. Подробные результаты этих анализов представлены в следующих публикациях.
Обзор
В данной статье демонстрируется метод локальной фиксации потенциала (patch clamp) на срезах мозга для анализа изменений синаптических свойств и пластичности, вызванных обучением. Исследование сосредоточено на моторном познании и контекстном обучении у обученных крыс.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Электрофизиология
- Поведенческий анализ
Теоретические основы
- Метод локальной фиксации потенциала (patch clamp) на срезах мозга имеет решающее значение для изучения синаптической функции.
- Моторное познание можно оценить с помощью теста на вращающемся стержне (rotor rod).
- Контекстуальное обучение оценивается с помощью тестов на тормозное избегание.
- Понимание синаптической пластичности необходимо для понимания механизмов обучения.
Цель исследования
- Проанализировать синаптическую пластичность, индуцированную обучением, у крыс.
- Сравнить синаптические свойства обученных и необученных животных.
- Изучить нейромеханизмы моторного бега.
Используемые методы
- Тест на вращающемся стержне (ротароде) для оценки освоения двигательных навыков.
- Тест на тормозное избегание для анализа контекстуальной памяти.
- Подготовка срезов мозга и регистрация методом пэч-кламп.
- Методы фиксации тока и напряжения для анализа синаптической активности.
Основные результаты
- Двухдневное обучение привело к значительному улучшению двигательных навыков.
- У обученных крыс наблюдались улучшенные синаптические свойства по сравнению с необученными крысами.
- Данные в режиме фиксации тока показали повышение спайковой активности у обученных крыс.
- Результаты в режиме фиксации потенциала указали на изменения в миниатюрных постсинаптических токах.
Выводы
- Исследование подтверждает эффективность метода локальной фиксации потенциала (patch clamp) на срезах ткани.
- Обучение улучшает как моторные навыки, так и синаптическую пластичность.
- Эти результаты способствуют пониманию нейронных основ обучения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Метод патч-кламп на срезах позволяет напрямую измерять изменения возбудимости нейронов и синаптической силы, вызванные обучением, что дает возможность понять механизмы адаптации нейронных сетей. Данный подход способствует валидации мишеней при поиске новых нейротропных препаратов, связывая поведенческие фенотипы с клеточными и синаптическими фенотипами. Это повышает прогностическую уверенность на ранних этапах разработки, снижая риски гипотез о влиянии соединений на пути, связанные с пластичностью.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы путем измерения изменений потенциала покоя мембраны, порога возникновения спайка и сопротивления мембраны в обученных и необученных нейронах.
- Научная ценность: проясняет участие определенных путей, демонстрируя вызванное обучением повышение спайковой активности в пирамидальных нейронах слоев II/III моторной коры.
- Научная ценность: способствует биологическому снижению рисков путем количественной оценки синаптической пластичности как в возбуждающих, так и в тормозных синапсах нейронов области CA1 гиппокампа после контекстного обучения.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем (острых срезов мозга) для последующей оценки влияния соединений на внутренние и синаптические свойства нейронов.
- Научная ценность: Обеспечение стандартизации анализа за счет последовательной регистрации mEPSC и mIPSC от одного и того же нейрона, что снижает вариабельность при измерении синаптической силы.
- Научная ценность: Получение количественных данных (амплитуда, частота постсинаптических токов), которые позволяют проводить надежную оценку соединений в рамках кампаний по фенотипическому скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: демонстрирует полезность системы для изучения заболеваний путем моделирования пластичности, индуцированной обучением, в моторной коре и гиппокампе — областях, имеющих значение при когнитивных и двигательных расстройствах.
- Научная ценность: обеспечивает трансляционную преемственность от поведенческого обучения (вращающийся стержень, тормозное избегание) к клеточным показателям, что способствует валидации мишеней на основе механизмов действия.
- Научная ценность: облегчает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков путем идентификации соединений, которые нормализуют гиперреактивность или синаптический дисбаланс, индуцированные обучением.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в процесс разработки новых препаратов — от проверки гипотез до идентификации перспективных соединений (лидов), особенно для мишеней, модулирующих возбудимость нейронов или синаптическую передачу.
- Открыточная биология: Обеспечивает проверку гипотез путем сравнения свойств нейронов у животных, прошедших поведенческое обучение, и наивных животных для подтверждения воздействия на мишень.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет стабильных и воспроизводимых записей методом патч-клампа всего нейрона (whole-cell patch clamp) в острых срезах, что позволяет проводить анализ зависимости «доза-ответ» для исследуемых соединений.
- Аналитика: Генерирует ключевые показатели, включая количество спайков, потенциал покоя, мембранное сопротивление, а также амплитуду и частоту mEPSC/mIPSC для количественной оценки нейронных и синаптических ответов.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преклиническую преемственность, связывая индуцированные обучением синаптические изменения с потенциальными биомаркерами дисфункции нейронных сетей в моделях нейропсихиатрических заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: Функционирует как переиспользуемая электрофизиологическая платформа, применимая для различных областей мозга (например, сенсорной коры, миндалевидного тела) и парадигм обучения, что максимально увеличивает эффективность использования ресурсов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов за счет уменьшения механистической неопределенности в вопросе о том, как обучение изменяет нейронную и синаптическую функции.
- Операционная ценность: Способствует стандартизации за счет четко определенных протоколов подготовки срезов, перфузии и регистрации данных, что повышает воспроизводимость результатов в разных лабораториях.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), предоставляя прямые электрофизиологические доказательства влияния мишени на пути пластичности.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию соединений с учетом рисков, выбирая те, которые обращают патологическую пластичность, не нарушая базовую функцию.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области электрофизиологии, нарезки срезов мозга и поведенческой нейробиологии для обеспечения качества и правильной интерпретации данных.
- Успех подготовки срезов и регистрации данных зависит от наличия такого оборудования, как вибратомы, усилители для патч-клампа, системы перфузии и инфракрасная DIC-микроскопия.
- Необходима стандартизация между группами, занимающимися поведением, гистологией и электрофизиологией, чтобы согласовать парадигмы обучения с временем получения срезов и выбором целевых областей.
- При применении метода к различным областям мозга или типам нейронов требуются определенные адаптации, такие как корректировка ориентации среза или состава внутриклеточного раствора.
- Метод ограничен острым характером срезов мозга, что исключает возможность лонгитюдных исследований, но позволяет сохранить нативную структуру нейронных цепей для проведения ex vivo анализа механизмов.
