Патч зажим Recordings от мыши нейронов сетчатки в темно-адаптированной фрагмент подготовка

Наш зрительный опыт начинается, когда зрительный пигмент в фоторецепторах сетчатки поглощает фотоны световой энергии, что в конечном итоге приводит к закрытию циклических нуклеотидных каналов в клеточной мембране. Это подавляет высвобождение нейромедиатора глутамата как из палочек, так и из колбочек. Высвобожденный глутамат воспринимается расположенными ниже клетками сетчатки для изучения нисходящих сигналов.

У усыпленной мыши удаляют глаза. S изолированы, встроены в агаровый блок и нарезаны с помощью вибрирующего микротома. Далее срезы сетчатки помещают под микроскоп и стимулируют с помощью светодиодного освещения.

В то время как записи с помощью патч-клещей делаются для измерения генерируемых синаптических токов или потенциалов. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за дополнительных сложностей работы в темноте. Таким образом, возможность визуализировать весь процесс создаст ощущение, которое иначе трудно описать.

Начните эту процедуру с покрытия записывающих электродов и электродов контрольного провода, которые будут использоваться, слоем хлорида серебра. Опустите электроды в один моляр хлорида натрия. Затем с помощью 15-вольтового источника питания с синусоидальным приводом в один герц 15 вольт между ними в течение примерно 20 секунд.

С помощью съемника микропипеток подготовить патч-пипетки из кварцевого стекла, отполированного огнём BO, выбирая сопротивление наконечника пипетки исходя из размера целевых клеток для клеточных тел около 20 мкм в диаметре. Используйте трубчатый ПЭТ с сопротивлением зонда от пяти до 10 мегаом для тел клеток. После примерно пяти микрон в диаметре используйте сопротивление зонда от 12 до 15 мегаом.

Для подготовки заземляющих электродов сравнения с помощью шприца необходимо заполнить полиэтиленовую трубку раствором 3,5%-ного агара, приготовленным в одном миллимоляре хлорида натрия. Далее приготовьте следующие растворы согласно инструкции в прилагаемом письменном протоколе. Раствор для нарезки наружной ванны, раствор для пипетки аспартата калия внутренний раствор и агаровый упор.

Храните все растворы при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся. В день эксперимента Тор принял около 1,5 миллилитров внутреннего раствора аспартата калия. Затем добавьте разведенный фтор.

Налейте около 50 миллилитров целевых сред, содержащих бикарбонат натрия, в легкогерметичный контейнер для хранения. Подсоедините пластиковую трубку к газовому баллону, содержащему 5% углекислого газа и 95% кислорода, чтобы уравновесить целевую среду с газом, а затем поместите контейнер в водяную баню с температурой от 30 до 32 градусов Цельсия. Далее наполните бутылку 110 миллилитровыми препаратами, содержащими горох и поставьте ее на лед.

Уравнивайте среду, барботируя раствор со 100% газообразным кислородом. Поместите оставшуюся среду aimes, содержащую бикарбонат натрия, в нагретый резервуар на верхней части клетки Фарадея. Оберните параформу вокруг трубки и крышки бутылки, чтобы улавливать газ в пространстве над раствором и уравновешивать 5% углекислого газа, 95% газообразного кислорода.

Используя стеклянную воздуходисперсионную трубку, приготовьте 3% низкую температуру гелеобразования, добавив 0,75 грамма к 25 миллилитрам целевой среды с высокой температурой. Раствор составляет около 115 градусов Цельсия при перемешивании. Когда раствор станет прозрачным без пузырьков, поместите расплавленный раствор агара на водяную баню при температуре 42 градуса Цельсия.

Установите записывающую камеру на инвертированный микроскоп. Наденьте пятисантиметровый агаровый мост на электрод сравнения из серебра и хлорида серебра и поместите его в записывающую камеру. Сопротивление наконечника пипетки можно измерить, заполнив пипетку внутренним раствором, поместив его на держатель пипетки, поместив держатель пипетки в столик усилителя и опустив пипетку в раствор для сохранения визуального пигмента для физиологических записей, все процедуры должны выполняться под инфракрасным светом с использованием инфракрасных очков, но все процедуры здесь будут показаны при комнатном освещении.

После того, как мышь была усыплена, используйте изогнутые ножницы, чтобы быстро удалить глаза. Поместите глаза на лист фильтровальной бумаги, чтобы они не скатывались. Затем удерживайте глаз на месте щипцами и с помощью тонкого двустороннего лезвия сделайте разрез в роговице.

Как только глазное яблоко будет проколото. Перенесите глаз в 60-миллиметровую чашку Петри, наполненную целями среды. Используя разрез в роговице в качестве точки входа, с помощью маленьких ножниц отрежьте оставшиеся части роговицы.

Затем снимите хрусталик и стекловидное тело, следя за тем, чтобы сетчатка оставалась прикрепленной к наглазнику. Поместите его в легкую плотную емкость, наполненную асимами. Среда уравновешивается 5% углекислого газа и 95% кислорода при 32 градусах Цельсия.

Далее хемис сек. Один из наглазников с помощью скальпельного лезвия под номером 10. Отделите сетчатку от пигментного эпителия сетчатки.

Удалите края сетчатки, чтобы ткань стала плоской. С помощью небольшой стеклянной пипетки для пасты с латексной колбой заполните 35-миллиметровую чашку Петри расплавленным агаром с низкой температурой гелинга и протяните щипцы через агар, чтобы проверить его консистенцию. Как только агар начнет затвердевать, перенесите сетчатку в верхнюю часть агара.

Затем, не касаясь сетчатки, с помощью скрученного кусочка салфетки Кима впитайте излишки раствора вокруг нее. Поместите дополнительно две-три капли агара непосредственно на сетчатку глаза и быстро поместите пластиковый цилиндр, чтобы образовалась стенка вокруг него, при этом сохранив сетчатку возле центра цилиндра, капните дополнительно растопленный агар, перенесите чашку Петри на ледяную водяную баню для охлаждения. Через 30 секунд извлеките ткань и с помощью поршня выдавите агаровый блок, надавливая с самой дальней от сетчатки стороны

С помощью одностороннего лезвия бритвы вырежьте небольшой блок агара, содержащий сетчатку, и приклейте блок на место к упору агара на диске для образцов. Перенесите диск с образцом на вибрирующее дерево микротомов и насыпьте ледяные кучи прицелов в дерево, позволяя блоку с сетчаткой полностью погрузиться в воду. Нарежьте срезы сетчатки толщиной около 200 микрон, используя максимальную скорость вибрации лезвия при скорости движения вперед лезвия, установленной таким образом, чтобы для разрезания сетчатки требовалось четыре-пять секунд. Однажды.

Используйте лезвие скальпеля под номером 11, чтобы вырезать каждый пригодный для использования кусок блока по одному. Поместите срезы, содержащие сетчатку, в записывающие камеры и удерживайте их. С помощью слайсов анкеры нейлоновые нити пересекают срез анкера.

Удерживайте агар, окружающий сетчатку, оставляя сетчатку свободной. Для записей. Перенесите записывающую камеру на столик вертикального микроскопа.

Закройте шторку и включите источник инфракрасного света, чтобы просмотреть срез на инфракрасной чувствительной камере. Под микроскопом определите срез сетчатки с неповрежденными фоторецепторами под соответствующим углом разреза. Некоторые повреждения поверхности могут быть заметны в процессе нарезки.

С помощью пипетки со сломанным наконечником аккуратно отсосите мертвые тела клеток Чтобы удалить этот тонкий слой клеток, как только будет обнаружен здоровый слой живых клеток, определите тело клетки, положение которого находится в интересующих слоях. Переместите наконечник пипетки так, чтобы он углубил клеточную мембрану, и приложите мягкое, отрицательное или внутреннее давление, чтобы обеспечить высокопрочное уплотнение. Режим всей ячейки может быть достигнут путем приложения отрицательного давления к электроду для проникновения в ячейку.

Затем стимулируйте ткань сетчатки светом с помощью светодиодов, чтобы вызвать ответные реакции. В конце записи сделайте снимок с использованием соответствующего возбуждающего света для флюоруориста, который диализуется в клетку из внутреннего раствора пипетки. Здесь показаны световые потенциалы темного адаптированного нейрона сетчатки к вспышкам света возрастающей силы.

Этот рисунок представляет собой флуоресцентное изображение, сделанное из среза сетчатки, где клетки были заполнены желтой флуоресценцией Fluor Lucifer, показывает морфологию клеток, из которых были сделаны патч-записи. После просмотра этого видео вы должны лучше понять некоторые сложности создания записей с помощью патч-фикса из темных адаптированных срезов сетчатки. Цель этой процедуры состоит в том, чтобы измерить реакции, вызванные светом, при контролируемом освещении.

Для этого нам нужно сначала изолировать сетчатку, встроить ее в шнек, а затем подготовить срезы сетчатки, из которых мы сможем сделать записи отдельных клеток.