Компьютерный многоэлектродной патч-зажим система

Общая цель этой процедуры заключается в выполнении записи до 12 клеток в режиме всей клетки. Для этого сначала отмечается положение каждой интересующей клетки и назначается пипетка для каждой клетки. Второй шаг — найти кончик каждой пипетки и автоматически переместить пипетки рядом с назначенными им ячейками.

Затем подойдите к каждой ячейке с помощью одной пипетки за раз. Чтобы установить плотные уплотнения с клеточной мембраной, последним шагом является разрыв мембраны клеток и выполнение записи всей клетки. В конечном счете, компьютерная запись с помощью многоэлектродного патч-зажима используется для демонстрации сетевых свойств небольших нейронных цепей с высоким разрешением.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как ручной зажим патч-фикса, заключается в том, что количество соединений, которые можно наблюдать в сети, растет с квадратом количества нейронов, которые записываются. Визуальная демонстрация этой техники важна, потому что этапы зажима патча могут быть сложными для изучения из-за сложности и скорости, с которой они должны быть выполнены. Начните эту процедуру с размещения среза мозга с интересующей областью в центре диапазона смещения микроскопа.

Далее определите интересующие вас ячейки. Затем сохраните положение ячеек на основе системы координат микроскопа. Графический интерфейс отобразит выбранные ячейки, а также микропипетки для глобального обзора, а программное обеспечение добавит маркер положения ячейки, который будет наложен на изображения.

Кроме того, создается изображение ячейки для дальнейшего использования. После выбора интересующих клеток назначьте пипетки, которые будут использоваться для записи отдельных ячеек, назначив элементы управления назначением в графическом интерфейсе. Визуализируйте предварительный просмотр окончательной конфигурации, установив флажок «Показать конечные позиции».

Теперь приготовьте пипетки с внутриклеточным раствором и поместите их на держатели. Поместите головные ступени в фиксацию, но не сдвиньте их вперед. Чтобы не касаться ванны наконечником пипетки, включите регулятор положительного давления и выберите все пипетки.

Чтобы кончики оставались чистыми, аккуратно сдвиньте каждую ступень головки на место. Затем расположите микроскоп в центральном положении с фокусом на два миллиметра над срезом, нажав кнопку R two и удерживая кнопку A. Используйте соответствующее положение для каждого манипулятора, сохраненное в предыдущем эксперименте, нажимая кнопку L two, удерживая кнопку A.At этой точке, в поле зрения должна быть либо характерная тень пипетки, либо небольшого движения вдоль оси пипетки должно быть достаточно чтобы наблюдать за ним. Компенсация незначительных различий в форме пипетки должна быть выполнена вручную.

Затем сфокусируйте наконечник пипетки. Затем поместите наконечник на красную центральную точку видеодисплея. Не перемещая микроскоп, сообщите программному обеспечению, что пипетка находится в центре дисплея, нажав кнопку Z и удерживая кнопку C контроллера.

После того как наконечник для дозатора будет найден, отправьте его назад, чтобы можно было найти следующий, нажав кнопку L One и удерживая кнопку a. После того, как все наконечники пипеток будут точно расположены и каждая пипетка будет отнесена к ячейке. Автоматически размещайте пипетки рядом с соответствующими ячейками, просто щелкнув правой кнопкой мыши по центру группы ячеек в графическом окне представления и выбрав опцию кластера во всплывающем меню.

В окне параметров кластера выберите все пипетки, которые вы хотите разместить в данный момент, и нажмите кнопку «Перейти» с отмеченными пипетками. Повторите эту процедуру для каждого кластера интересующих вас ячеек. Чтобы выполнить окончательный подход, укажите положение пипеток относительно клеток на расстоянии 200 мкм от клетки по оси пипетки и на 200 мкм над ней в вертикальном направлении, что достаточно для удержания кончика пипетки за пределами ткани.

Затем подождите, пока не будет завершено позиционирование пипеток. Затем переместите микроскоп в сторону пипетки, нажав кнопку R One, удерживая кнопку C. Откалибруйте каждое положение пипетки, сфокусировав микроскоп на его наконечнике в любом месте видеодисплея и нажав кнопку B при удержании кнопки C. Квадратная сетка должна на короткое время появиться, указывая на определенное положение пипетки. Если положение неверное, расположите наконечник на центральной точке видеодисплея и нажмите кнопку Z, удерживая кнопку C контроллера.

Теперь подтвердите, что интересующая ячейка для текущей пипетки правильно помечена, активно помечена. В противном случае переместите микроскоп так, чтобы интересующая вас ячейка соответствовала центральной красной точкой, отметьте ячейку, нажав кнопку Y, удерживая кнопку C. Затем нажмите кнопку L два, удерживая кнопку, C.To расположите пипетку на расстоянии 200 микрон от назначенной ячейки, микроскоп автоматически переместится в соответствующее положение. Отрегулируйте положение пипетки так, чтобы оно совпадало с красной точкой.

Затем отрегулируйте смещение пипетки, нажав кнопку R one. Удерживая кнопку x. Активируйте тестовый импульс, нажав кнопку L One, удерживая кнопку x.

После этого медленно переместите пипетку к отведенной ей ячейке. Наблюдая образование ямочки на поверхности клеточной мембраны, подайте короткий импульс отрицательного давления, нажав кнопку Y и удерживая кнопку Z, чтобы приложенное давление достигло клетки. Удерживающий потенциал около отрицательных 65 милливольт должен быть установлен в этой точке путем нажатия кнопки L two при удержании кнопки x.

Как только для каждой клетки будет сформировано гига-уплотнение, начните разрывать мембраны, оказывая отрицательное давление. Затем используйте систему сбора данных о стимуляции для выполнения записи. Подавайте импульсы или последовательности импульсов на отдельные клетки по одному за раз и наблюдайте за реакцией остальных клеток, чтобы отобразить связь между этими записанными клетками.

После завершения записи медленно отделите пипетки от ткани, щелкнув правой кнопкой мыши по переключателю стола. Выберите пипетки с отступлением 500 микрон, чтобы пипетки отступили на небольшое расстояние вдоль своей оси. Затем проследите за дрейфом потенциала клеток по удалению пипеток на обратном направлении.

Установите скорость позиционирования на «Быстрая» и повторите ту же операцию, но выберите вариант «Все». Извлеките использованные пипетки, осторожно выдвинув ножки головки и открутив пипетки от держателей. Вот пример сетей прямых синаптических связей, отображенных в отдельных экспериментах.

Эти три диаграммы связности представляют собой наборы из 12 параметаллических клеток, записанных в пятом слое с соответствующими межсоматическими расстояниями. А вот диаграмма связности, наложенная на морфологическое окрашивание зарегистрированных клеток параметалла. На этом рисунке показан эффект общего соседа.

Синие столбцы обозначают пары нейронов, которые одновременно соединены по крайней мере с одним другим нейроном в выборочной сети. Рисунок Значительно повышенная вероятность взаимосвязанности. Здесь показано, что пары нейронов, имеющих несколько общих соседей, встречаются чаще, чем ожидалось, случайно в выборочных сетях, вероятность соединения внутри пар нейронов увеличивается в зависимости от числа общих соседей, общих для плательщика.

Эти свойства, в свою очередь, порождают кластерные сети small world. На этом рисунке показана количественная оценка набора клеток Мартина. Это графическое изображение ячейки параметалла красного цвета, которая образует синапсы на ячейке Мартина nty синего цвета, которая, в свою очередь, образует синапс на второй ячейке параметалла.

В черном супра сверхпороговая стимуляция параметаллической ячейки приводит к рекрутированию ячейки Мартина. Посредством интеграции способствующих возбуждающих постсинаптических потенциалов, рекрутированная клетка Martin nty затем ингибирует вторую клетку параметалла. На этой диаграмме показана стимуляция растущего числа зажатых параметаллических клеток и воздействие на другую параметаллическую ячейку.

Вот усредненные ингибирующие постсинаптические потенциалы, зарегистрированные в параметаллической клетке в зависимости от количества других близлежащих параметаллических клеток, которые стимулируются. Амплитуда синаптического торможения DYS в локальной цепи имеет тенденцию к насыщению при стимуляции девяти или более параметаллических клеток, а доля клеток, получающих синаптическое торможение DYS, быстро возрастает до одной по мере стимуляции все большего числа параметаллических клеток. При попытке выполнить эту процедуру важно содержать кончики пипеток в чистоте и свести к минимуму деформацию тканей, избегая попадания кровеносных сосудов и других клеток во время фазы подхода.

После этой процедуры могут быть использованы дополнительные методы, такие как фотостимуляция, для решения дополнительных вопросов, таких как инновация заплатенных зажимных ячеек другим типом клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как ускорить и выполнить процедуру зажима пластыря для нескольких нейронов.