Епископская микроскопия высокого разрешения (HREM) - Простые и надежные протоколы для обработки и визуализации органических материалов

Общая цель этой процедуры заключается в создании цифровых объемных данных органических материалов. Примерами являются эмбрионы и эмбриональные ткани биомедицинских модельных организмов, блоки тканей, собранные у взрослых животных и человека, включая биопсию кожи или мышц, а также такие материалы, как немелованная бумага и заменители кожи. HREM помогает ответить на фундаментальные вопросы в области медицины и биомедицинских исследований.

Он позволяет проводить трехмерный анализ и визуализацию органов и тканей, например, генетически модифицированных эмбрионов мышей или модифицированных эмбрионов цыплят. Он также позволяет анализировать модели рака, а также биопсии, взятые из тканей человека или животных. Основное преимущество HREM заключается в том, что он предоставляет простой способ создания стопок изображений с близким к гистологическому качеству.

Применение этого метода распространяется на исследование заживления ран с использованием животных моделей, а также на прядение и исправление патологий тканей у людей. Демонстрировать процедуру будут BMR Марлен Родлер и Йоханнес Гюнтер. Оба из Венского медицинского университета, отделение анатомии.

Начните с неподвижных эмбрионов или эмбриональных тканей размером не более 5 х 5 х 5 кубических миллилитров. Снимите фиксатор. И добавить PBS.

Стирать при температуре четыре градуса Цельсия при постоянном покачивании в течение 24 часов. Добавьте 70% этанола в пробирки, содержащие ткань, и поместите образцы на вращатель при температуре четыре градуса Цельсия. Через два-три часа продолжайте обезвоживать образцы в растворах этанола возрастающей концентрации в течение двух-трех часов каждый раз.

Пока образцы обезвоживаются, готовят инфильтрационный раствор, добавляя в стакан 0,3125 грамма перекиси бензоила и 0,1 грамма ЭСН на 25 миллилитров раствора А. Перемешивайте на магнитной мешалке при температуре четыре градуса Цельсия в течение двух-трех часов, пока ЭСН и катализатор полностью не растворятся. Поместите образцы в инфильтрационный раствор.

И вращайте образцы в течение 12-24 часов при температуре четыре градуса Цельсия. Начните с приготовления раствора для встраивания. Добавьте один миллилитр или раствор Б к 25 миллилитрам свежего раствора для инфильтрации.

После подготовки формовочных чашек лотков заполните глубокую полость форм закладочным раствором. Переложите образцы в формочки с помощью ложки. Убедитесь, что образец полностью покрыт раствором для заделки, чтобы избежать захвата воздуха.

Сориентируйте образец внутри формы с помощью игл или щипцов. Крайне важно оптимизировать ориентацию образца во время заделки и отметить его точное положение на поверхности блока. Таким образом, область интереса может быть уменьшена и можно использовать объектив с максимально возможным увеличением.

Как только раствор для заделки начнет становиться вязким, поместите держатель блока на верхнюю часть формы и добавляйте раствор для встраивания через центральное отверстие держателя блока до тех пор, пока раствор для заделки не поднимется на один-два миллиметра над основанием держателя блока. Запечатайте противень формовочной чашки, покрыв его жидким парафином, и подождите, пока он застынет, прежде чем перемещать. Дайте блокам закончить полимеризацию, храня герметичные формовочные лотки для чашек в течение одного-двух дней при комнатной температуре.

Для обработки после полимеризации поместите формовочные чашечки с полимеризованными блоками в стандартную лабораторную печь и выпекайте при температуре от 70 до 80 градусов Цельсия в течение как минимум одного-двух дней. Выньте блоки из формочек. Затем определите поле зрения, направив белый свет косо на поверхность блока.

Обведите тень образца черным маркером на поверхности блока. Установите смоляной блок с указанным полем зрения на микротом и переместите держатель блока в положение остановки. Запустите цифровую камеру и программное обеспечение для генерации данных и получите изображение в режиме реального времени.

Выберите объектив с подходящим увеличением, чтобы охватить интересующую область. Перемещайте оптический прицел вверх и вниз, а также микротом в боковом направлении, пока интересующая область не совпадет с полем зрения, отображаемым на экране компьютера. Секционируйте блок до тех пор, пока не станут видны первые структуры образца.

Переместите микротом, чтобы расположить поверхность блока в фокальной плоскости оптики. Выберите толщину профиля от 0,5 до пяти микрон. Затем, настроив программное обеспечение в соответствии с инструкциями производителя, запустите программное обеспечение и начните сбор данных.

На этом изображении сечения HREM показан сагиттальный срез эмбриона мыши, собранного на 9,5-й день эмбрионального периода. Эта объемная 3D-модель показывает поверхность этого эмбриона. На этом изображении показан виртуальный сагиттальный срез через объемную визуализированную модель шейки эмбриона мыши, собранного на эмбриональный день 15,5.

Модель поверхности выделяет просвет сердечно-сосудистой системы в объемной визуализации всех тканей куриного эмбриона, развивающегося по Гамбургеру Гамильтона стадии 18. На этом изображении показан участок HREM через нерв человека. Вкладыш увеличивает часть этого изображения.

На этом изображении показана часть сечения HREM через свиную печень. На этом изображении показана объемная 3D-модель биопсии, взятая с подушечки большого пальца человека. На этом изображении показаны поверхностные модели дермальных артерий, вен и нервов перед виртуальной резекцией на основе данных HREM.

В этой анимации показана объемная визуализированная модель толстой кожи подушечки большого пальца человека. Разные пороги и, следовательно, разные дермальные структуры, такие как кровеносные сосуды, нервные волокна, потовые железы и протоки потовых желез. HREM позволяет быстро визуализировать архитектуру волокнистого материала.

На этом изображении показана объемная модель нативного кожного заменителя. В этой анимации показана объемная визуализированная модель кожного заменителя. Обратите внимание на различную форму и калибр волокон.

Образцы должны быть обезвожены, инфильтрированы и погружены в смолу, поэтому вся процедура может занять до нескольких дней, но включает в себя всего два-три часа оперативных работ по приготовлению растворов, смене растворов и так далее. Сама генерация данных полностью автоматизирована на аппарате HREM, и 1000 изображений могут быть получены за два-три часа. После его разработки HREM проложил путь исследователям в области биологии развития к точной оценке фенотипа мутантных эмбрионов мышей.

Одним из примеров является проект «Расшифровка механизмов нарушений развития» или DMDD, в котором HREM использует фенотипирование, эмбрионально летальные эмбрионы мышей в еще неизвестных деталях. Оказалось, что HREM также является отличной альтернативой позиционной световой микроскопии для изучения кровеносных сосудов, нервов или архитектуры волокон в образцах тканей человека.