Количественного определения микроорганизмов при низких концентрациях, с использованием голографической цифровой микроскопии (DHM)

Общая цель этого эксперимента — продемонстрировать обнаружение микроорганизмов на очень низких уровнях с помощью цифровой голографической микроскопии. Этот метод более чувствителен, чем традиционная световая микроскопия, и предоставляет информацию о поведении бактерий в режиме реального времени. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в биологической и космологической областях, таких как поиск патогенных организмов в воде или жизни в нашей Солнечной системе на ледяных лунах.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что DHM является объемным методом, что означает, что мы можем мгновенно захватывать трехмерную информацию на нашем образце без необходимости физической перефокусировки. Применение этого метода распространяется на диагностику инфекций кровотока или спинномозговой жидкости из-за способности обнаруживать низкие концентрации бактерий. Чтобы начать эту процедуру, в день проведения эксперимента необходимо снять спектрофотометрические показания мастер-культуры бактерий, которые, как ожидается, будут находиться в диапазоне от 0,6 до 0,7.

Затем возьмите образец мастер-культуры и подсчитайте клетки непосредственно с помощью счетной камеры Петрова-Хауссера для подсчета как живых, так и мертвых клеток. Перенесите в камеру 10 микролитровый образец неразведенной культуры с помощью микропипетки. Сфотографируйте его под микроскопом с высоким содержанием сухого объектива с использованием фазового контраста.

Затем подсчитайте бактерии не менее чем в 20 квадратах и усредните их. Рассчитайте концентрацию как среднее значение 20 квадратов, умноженное на коэффициент разбавления. Чтобы перечислить только живые клетки, произведите серийное разведение каждого из отобранных бактериальных образцов стерильным 0,9%-ным физиологическим раствором, перенеся 20 микролитров бактериального раствора в другую лунку и разбавив его 180 микролитрами физиологического раствора.

Повторяйте процедуру до тех пор, пока самая низкая концентрация не составит примерно 10 к трем клеткам на миллилитр. Затем возьмите 100 микролитров образцов не менее чем из двух разведений и нанесите их на соответствующие планшеты с твердой средой. Распределите их стерильным разбрасывателем и выполните не менее трех повторений каждого разведения.

После этого инкубируйте их при соответствующей температуре в течение ночи или до тех пор, пока колонии не вырастут. Затем посчитайте колонии. Рассчитайте колониеобразующие единицы и усредните их по репликам.

В этой методике производят серийные разведения мастер-культуры на ДГМ и пост-ДГМ подсчет КОЕ на слизистых средах Lysogeny бульона. Разбавьте бактерии в 25 миллилитрах минимальной среды, которая будет стимулировать подвижность, но подавлять деление клеток, чтобы концентрация клеток не менялась заметно во время эксперимента. Для записи видео с ДГМ с помощью стерильного шприца вберите около 10 миллилитров интересующего разведения.

Затем подсоедините шприц к камере для отбора проб DHM с помощью стерильных фитингов и трубки. Непрерывно подавайте образец из шприца через камеру для образцов с помощью шприцевого насоса. По мере того, как образец проходит через камеру образца, получайте голограммы последовательно с соответствующей частотой кадров.

Дайте достаточно времени, чтобы все 10 миллилитров образца прошли через DHM. Чтобы гарантировать, что бактерии не растут и не умирают во время экспериментов, инокулируйте планшеты с обогащенными средами 100 микролитрами отработанной среды после получения изображений с помощью ДГМ, распределив их с помощью стерильного распределителя. Затем инкубируйте их при соответствующей температуре в течение 24 часов до подсчета колоний.

Точное количество клеток имеет важное значение для количественного определения пределов обнаружения. Важно тщательно проводить все разведения с помощью калиброванных микропипеток и подтверждать все подсчеты оптической плотностью, покрытием и прямым подсчетом в камере Петроффа-Хауссера. Чтобы проанализировать данные о присутствии бактерий в полученных голограммных видео, проведите фильтрацию с вычитанием среды, предварительно преобразовав изображения в 32-битный формат.

Затем рассчитайте медианное значение в пикселях. Наконец, вычтите это медианное значение из каждого соответствующего пикселя, чтобы устранить стационарные артефакты в голограмме. После этого вручную посчитайте количество колец видимой области и ячеек в фокусе.

Каждая серия голограмм будет сопровождаться файлом временных меток. Используйте файл временных меток для вычисления общего объема выборки, перекачанной на момент создания изображения. Затем рассчитайте плотность клеток, разделив общее количество обнаруженных клеток на общий объем изображенного образца.

В среднем от пяти до 10 кадров для точной статистики. На этом графике показано прогнозируемое количество ячеек в поле зрения на основе объема образца 365 микрометров на 365 микрометров на один миллиметр. Для концентраций, при которых количество клеток в поле зрения меньше единицы, для обнаружения требуется несколько изображений.

Это последовательность голограммы DHM культуры Serratia marcescens при концентрации 2 100 клеток на миллилитр, измеренной по количеству планшетов. Последовательность показывает одну ячейку примерно каждые одну-две секунды, что отлично подходит для прогноза. И это еще одна последовательность голограммы DHM культуры Serratia marcescens с концентрацией 620 клеток на миллилитр, измеренной по количеству пластин.

Эта последовательность показывает одну клетку примерно каждые шесть-семь секунд. При использовании цифровой голографической микроскопии для визуализации клеток не забывайте использовать методы стерилизации фильтром при приготовлении всех растворов. Это позволит избежать попадания твердых частиц в прибор.

Приступая к этой процедуре, важно помнить о подготовке здоровых клеточных культур и иметь под рукой дополнительную среду для роста, планшеты и среду для подвижности. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как флуоресцентное окрашивание, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как процент живых и мертвых клеток. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области микробиологии к изучению трехмерной подвижности в культивируемых клетках и образцах окружающей среды.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как подсчитывать бактерии с помощью голографической микроскопии и проверять результаты с помощью других методов подсчета. Не забывайте, что работа с бактериальными культурами может быть крайне опасной. При выращивании и обработке живых организмов всегда следует принимать соответствующие меры биобезопасности.