Обнаружение редких событий, с помощью Исправлена ошибка ДНК и РНК последовательности

Секвенирование нового поколения (НГС) является мощным инструментом для геномной характеристика, который ограничен высокой погрешность платформы (~0.5–2.0%). Мы описываем наши методы Исправлена ошибка последовательности, которые позволяют нам избежать NGS ошибка оценить и выявить мутации в вариант аллеля фракций же редки, как 0,0001.

Этот метод может помочь ответить на некоторые ключевые вопросы в различных областях исследований, таких как обнаружение предраковых клонов, прогностическая оценка пациентов с лейкемией после лечения и идентификация потенциально патогенных мутаций у доноров костного мозга. Демонстрировать эту процедуру со мной будет Спенсер, он работает техником в лаборатории. В этом видео описывается, как объединить протокол секвенирования с коррекцией ошибок с химическими данными Illumina и коммерчески доступными генными панелями для обнаружения клональных однонуклеотидных вариантов и малых инделов с чувствительностью один к 10 000.

Чтобы включить необходимые уникальные молекулярные идентификаторы, индивидуальные адаптеры 16N i5 и i7 используют ПЦР. Во-первых, приготовьте мастер-смесь Q5, в которой используется полимераза с более высокой точностью, чем коммерчески доступная альтернатива. Затем для каждой реакции соедините 37,5 микролитров Q5 Master Mix, шесть микролитров пяти микромолярных адаптеров 16N i5, которые являются уникальными молекулярными идентификаторами, и шесть микролитров адаптеров i7.

Если цель — мультиплексирование, то используйте разные адаптеры i7 в отдельных выборках. Теперь запустите ПЦР с использованием следующих параметров: тридцать секунд при 98 градусах Цельсия, затем от четырех до шести циклов по десять секунд при 98 градусах Цельсия, тридцать секунд при 66 градусах Цельсия и тридцать секунд при 72 градусах Цельсия. Завершите реакцию с двухминутным удлинением при температуре 72 градуса Цельсия и удерживайте при температуре четыре градуса Цельсия.

Тогда оба цикла ПЦР, которые вы должны сделать на них, скорее всего, зависит от размера генной панели, которую вы используете, по нашему опыту, четырехцикловой ПЦР достаточно, если генная панель содержит около 1500 различных путей ген-специфических олигон, тогда как панель с примерно пятью до 600 парами олигонухи требует около шести циклов ПЦР. Затем очистите реакции ПЦР с помощью магнитных шариков, добавьте 56,25 микролитров раствора магнитных шариков в каждый 75-литровый продукт ПЦР, затем перенесите каждую реакцию в отдельную 1,5-миллилитровую пробирку с низким связыванием, перемешайте пипетированием вверх и вниз не менее десяти раз, и подождите пять минут. Затем переложите смеси в магнитный держатель и дайте надосадочной жидкости очиститься в течение двух минут.

Затем удалите и выбросьте надосадочную жидкость. Далее добавьте 200 микролитров 70%-ного этанола, подождите тридцать секунд, а затем удалите этанол. Повторите этот шаг промывки этанолом один раз, а затем дайте шарикам высохнуть на воздухе в течение пяти минут.

Наконец, разбавьте модифицированные библиотеки из бусин в двадцати микролитрах дважды дистиллированной воды. Затем поместите трубки на магнитный штатив, чтобы отделить магнитные шарики от элюента. Во-первых, выполните десятикратное последовательное разведение библиотек ECS с предыдущего этапа, вплоть до одной части на 1000 в ПЦР-стрипах.

Далее приготовьте Master Mix в тубе объемом 1,5 миллилитров. Для каждой реакции соедините 10 микролитров ddPCR EvaGreen Mix, 0,2 микролитра праймера Р5, 0,2 микролитра праймера Р7 и 4,6 микролитра двойной дистиллированной воды. Затем напипируйте 15 микролитров EvaGreen Master Mix в новый набор пробирок и, наконец, добавьте пять микролитров от одного до 1 000 очищенного продукта ECS в Master Mix.

Далее сделайте капли ПЦР с помощью генератора капель. Сначала загрузите кассету, нанесите 70 микролитров масла для генерации капель в лунку кассеты, меченое масло, и напипируйте 20 микролитров реакционной смеси ddPCR в хорошо маркированный образец. Затем накройте кассету резиновой прокладкой, и загрузите ее в каплегенератор, и вся генерация капель продолжится.

Теперь с помощью многоканальной пипетки медленно, в течение пяти секунд, загрузите 45 микролитров капель, взятых из каждой кассетной лунки, на новую ПЦР-тарелку. Затем запечатайте ПЦР-планшет алюминиевой фольгой. Теперь усилите сигнал в каплях, используя следующие условия: пять минут при 95 градусах Цельсия, затем 40 циклов по тридцать секунд при 95 градусах Цельсия и одна минута при 63 градусах Цельсия, затем охладите реакцию до четырех градусов Цельсия в течение пяти минут, прежде чем поднять ее до 90 градусов Цельсия на пять минут. а затем удерживать при температуре четыре градуса по Цельсию.

Далее подготовьте считыватель шаблонов капель ddPCR. Выберите параметры для абсолютного количественного определения, а также используйте QX200 ddPCR EvaGreen Supermix. Затем пропустите реакции через считыватель капель.

Когда анализ ddPCR будет завершен, примените к каждому образцу одинаковые пороговые значения. Затем нормализуйте каждую библиотеку до нужного количества молекул. Начните с проведения 50 микролитровых реакций, состоящих из 25 микролитров Q5 Master Mix, двух микролитров одного микромолярного праймера P5, двух микролитров одного микромолярного праймера P7 и 21 микролитра нормализованной библиотеки ДНК.

Затем запустите ПЦР с использованием следующих параметров: 30 секунд при 98 градусах Цельсия, затем 16 циклов по 10 секунд при 98 градусах Цельсия, тридцать секунд при 66 градусах Цельсия и тридцать секунд при 72 градусах Цельсия, затем две минуты при 72 градусах Цельсия и удерживайте при четырех градусах Цельсия. Затем количественно измерьте концентрацию ДНК в библиотеках и объедините библиотеки в равных молярных количествах для секвенирования, нацеливаясь примерно на четыре наномоляра. Теперь секвенируйте объединенную библиотеку ECS с помощью платформы секвенирования Illumina со следующими настройками секвенирования: два раза по 144 парных чтения, восемь циклов первого индекса и 16 циклов второго индекса.

ДНК пациента с мутацией в GATA1 была разбавлена в коммерческой геномной ДНК при исходном VAF 0,19. Используя описанный протокол, ЭКС оказалась количественной с точностью до 1 к 10 000 для однонуклеотидного варианта. Затем были проанализированы образцы охристой шерсти от двадцати здоровых особей с помощью коммерческой секвенированной панели, состоящей из 568 ампликонов.

Таким образом, 109 клональных соматических мутаций присутствовали в обеих репликах, по крайней мере, одного момента сбора с вариантными фракциями аллелей в диапазоне от 0,0003 до 0,1451,21 мутации с известными космическими репрезентациями, и каждая из них была проверена с помощью цифровой капельной ПЦР. Чтобы продемонстрировать скорректированный на ошибку уровень экспрессии протокола, была использована специализированная генная панель, состоящая из 415 генов, которые, как известно, связаны с различными видами рака, для создания библиотеки, построенной из наиболее часто экспрессирующегося экзона каждого гена. Уровень экспрессии транскрипта с низким содержанием был высоко воспроизводимым между репликациями.

Затем с помощью цифровой капельной ПЦР были проверены шесть выбранных генов с различной экспрессией. Сравнение показывает, что уровень экспрессии генов был правильно зафиксирован протоколом ECS, без необходимости нормализации. Как только вы освоите технику, эту технику можно с комфортом выполнить за полтора дня.

Основная часть времени будет занимать инкубацию, а ручная обработка занимает около 30-40% от общего необходимого времени, в зависимости от того, сколько образцов исследователи обрабатывают одновременно. При попытке выполнить эту процедуру очень важно иметь библиотеку секвенирования репликации для того же образца. Это даст вам больше уверенности в том, что низкочастотные мутации являются истинно положительными, если сама мутация является независимым ядром в обеих репликациях.

После этой процедуры можно было бы выполнить другие действия, такие как РНК ECS, чтобы ответить на такие вопросы, как обнаружение транскрипта с низким содержанием или слитого транскрипта. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в первую очередь в области гематологических злокачественных новообразований, и мы используем эту технику для изучения прелейкозных клонов у здоровых людей, а также для выявления минимально остаточной болезни у пациентов с лейкемией, находящихся в стадии ремиссии.