Многоцветный Покадровый изображений трансгенных данио рерио: Визуализация сетчатки стволовых клеток, активированных нейронов Целевые абляция сотовый

Экспрессия флуоресцентных репортеров у трансгенных животных позволяет проследить клеточные реакции на экспериментальные манипуляции в моделях живых болезней. Здесь селективная потеря клеток фармакологически индуцирована у рыб данио, многоцветных конфокалов с высоким разрешением. Изображения клеток-мишеней и ближайших соседей были получены до и сразу после этого, а их интервалы после анализа изображений лекарственного лечения демонстрируют активацию популяций эндогенных стволовых клеток и последующую замену клеток-мишеней на этапе восстановления.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии регенерации, такие как Каковы клеточные и молекулярные механизмы, используемые для регенерации дискретных типов клеток? Начните с переноса трансгенных яйцеклеток, собранных в результате спаривания, в чашку Петри, содержащую 0,3 x раствора данио, через 16 часов после оплодотворения. ДОБАВЬТЕ ПТУ для ингибирования активности тирозина АПФ до появления каких-либо признаков пигментации в ткани, представляющей интерес. Если эмбрион не является альбиносом, инкубируйте эмбрионы при температуре 28,5 градусов Цельсия.

Как только репортеры убедятся, поместите чашку Петри под флуоресцентный стереомикроскоп с зумом и отсортируйте по желаемой экспрессии трансгенов. Перед визуализацией. Приготовьте монтажный раствор с низким содержанием расплава 0,5% в зародышевой среде и храните его при температуре 40 градусов Цельсия.

При необходимости добавьте трику и ПТУ. Аккуратно перемешайте и верните до 40 градусов по Цельсию. Обезболите рыб, поместив их в эмбриональную среду, содержащую трику.

Примерно на три минуты рыба перестанет реагировать. Чтобы потрогать с помощью микропипетки, нарисуйте отдельных рыбок в обрезанный наконечник пипетки в объеме примерно 30 микролитров раствора анестетика. Далее переверните пипетку и дайте рыбе осесть на дно.

Прикоснитесь кончиком к монтажному раствору и дайте им переместиться под действием силы тяжести. Следите за тем, чтобы не разбавлять агро, чтобы его можно было использовать повторно. Слейте оставшийся обезболивающий раствор из микропипетки.

Затем с помощью того же наконечника переложите рыбу в чашку Петри. В примерно 30 микролитрах монтажного раствора осторожно сориентируйте рыбу так, чтобы интересующая область была центрирована в аэросной капле. Убедитесь, что рыба остается в нужной ориентации до тех пор, пока аэрос не застынет.

При желании в одну чашку Петри можно установить несколько рыб. После того, как аэрос застынет, транспортируйте рыбу на столик конфокального микроскопа и аккуратно добавьте в чашку среду для эмбрионов, содержащую трику плюс-минус ПТЕ, пока рыба полностью не погрузится в воду. Откройте программное обеспечение для обработки изображений и сфокусируйтесь на интересующей области для оптимального отображения клеточных и/или молекулярных деталей.

Используйте объективы с большим рабочим расстоянием и высокой числовой апертурой в программном обеспечении. Выберите подходящие флористические четверки из списка наборов. Нажмите на настройку спектра и внесите корректировки в диапазоны излучения.

Для получения четкого разделения репортерных сигналов и максимального соотношения сигнал/шум. Выберите соответствующую цель в раскрывающемся меню, чтобы убедиться, что все программно определенные предустановки настроены правильно. Чтобы сфокусировать лазеры и задать уровни мощности, выберите выход из таблицы поиска, который показывает насыщенность пикселей для каждого канала.

Далее установите чувствительность детектора для получения желаемого качества изображения, постепенно увеличивайте выход лазера до тех пор, пока интенсивность изображения не станет приемлемой. Избегайте насыщения пикселей в интересующей области и поддерживайте уровни лазера как можно ниже. Для уменьшения проблем с фотообесцвечиванием и фототоксичностью.

Убедитесь, что каждая лазерная линия выдает обнаруживаемый сигнал только в соответствующем канале, вручную включая и выключая лазеры при мониторинге всех каналов визуализации. Если перекрестные помехи отсутствуют, все каналы могут быть зарегистрированы одновременно. Затем скомпонуйте интересующую область с помощью функций масштабирования и поворота.

Затем установите скорость сканирования и размер изображения, используя более высокую скорость сканирования, минимизируя время пребывания лазера и увеличивая временное разрешение. Установите размер шага Z-размера в соответствии с экспериментальными потребностями. Здесь шаг размером 10 микрон используется для получения изображения семи оптических срезов ткани сетчатки.

После того, как соответствующие настройки будут определены, приобретите изображения Zack и сохраните. Затем переходите к следующей рыбе. Последовательная визуализация захвата и высвобождения может быть выполнена для отслеживания клеточных изменений в течение последующих дней в соответствии с инструкциями в сопроводительном письменном документе.

При проведении эксперимента с визуализацией с помощью нескольких репортеров лучше всего использовать полы, которые хорошо разделены, спектральны, однако это не всегда практично. Здесь мы покажем простой метод вычитания изображений с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом image J для разделения этажей с перекрывающимися профилями возбуждения и излучения. В нашем случае это GFP и YFP.

Методы визуализации, описанные в этом видео, были использованы для мониторинга меченых GFP стволовых клеток сетчатки во время абляции и регенерации биполярных нейронов сетчатки Для выполнения спектрального разделения собирайте изображения с помощью режимов последовательной визуализации и переменных настроек барьерного фильтра, которые позволяют получать перекрывающиеся четверки этажа независимо и частично разделять соответственно. После получения изображений используйте импорт ImageJ loci bio formas, чтобы открыть файлы изображений и запустить инструмент импорта. Перетащите интересующий файл в окно J изображения.

Разделите каналы на отдельные стеки с помощью флажка «Разделить каналы» в окне импорта, чтобы запустить плагин выравнивания трех TP. Нажмите на плагины, затем выровняйте стопки. Затем выровняйте три тп.

Стопки должны быть выровнены, чтобы обеспечить правильное вычитание. Выберите ссылочный стек в первом раскрывающемся списке и смещенный стек во втором. Отметьте галочками опции Использовать относительное начало координат XY и Использовать относительное начало координат Z и нажмите OK.

Чтобы начать процесс юстировки, нажмите кнопку регистрации объема. Появится новое окно, содержащее параметры выравнивания. Нажмите OK.

Этот раздел был оптимизирован дистрибьютором плагина, поэтому никаких изменений не требуется. Когда все будет готово, появится окно с выровненными стопками. Выберите вывод из выровненного окна, чтобы открыть окно вывода.

Это окно также оптимизировано и не требует изменений. Нажмите OK. В рабочей области появится новая стопка с выравниванием, добавленным в конец заголовка файла.

Чтобы устранить перекрестные помехи с помощью калькулятора изображений, нажмите «Обработать», затем «Калькулятор изображений». Выберите стек для вычитания на изображении один выпадающий список и стек, который будет использоваться при вычитании. В выпадающем списке «Изображение два» выберите «Вычесть» в раскрывающемся списке операции и нажмите кнопку «ОК».

Изображение J попросит обработать стек. Выберите Да. Должен появиться новый стек, который устранил перекрестные помехи между перекрывающимися каналами.

Объедините стопки, чтобы воссоздать одну и ту же структуру изображения перед выравниванием и вычитанием. Выбирая объединенные каналы в окне инструментов канала, инструмент позволяет объединить до четырех стеков в гиперстек. Наконец, раскрасьте каналы, отрегулируйте яркость и контрастность и сохраните файлы в виде tiff для изучения целевой потери и регенерации нитроредуктазы.

М. вишня, экспрессирующая биполярные клетки сетчатки. Временная серия конфокальных изображений была сделана у отдельных рыбок данио до начала лечения. В контролируемых биполярных клетках желтым цветом показана мозаичная экспрессия мембранного репортера YFP, а красным цветом показана белка слияние нитроредуктазы вишни в целевых биполярных клетках.

Мембрана, помеченная трансгеном CFP, показанная голубым цветом, предоставляет контекстуальную информацию о большинстве других клеток сетчатки для дополнительной ясности. То же изображение без сигнала CFP показано после лечения метронидазолом. Красные биполярные клетки, экспрессирующие нитроредуктазу, теряются, в то время как желтые контролируемые биполярные клетки остаются нетронутыми.

Это демонстрирует весьма специфический характер данной методологии абляции. Опять же, для наглядности показано то же изображение без CFP. Когда metro NIAZ удаляется, клетки, экспрессирующие NTR, возвращаются сюда.

Пример метода вычитания G-F-P-Y-F-P показан на этом рисунке GFP с меткой Мюллера. Зеленым цветом обозначены клетки GL, а меченые YFP биполярные клетки — фиолетовым. Наложение между ними дает белый цвет для выполнения вычитания.

Изображения GFP и YFP должны быть сначала выровнены. Затем процесс вычитания позволяет удалить меченые YFP биполярные клетки из изображения GFP, что позволяет четко представить меченые GFP клетки Мюллера и обнаружить более тусклые клетки Мюллера. Перекрытие между тусклыми биполярными клетками, меченными Мюллером, ggl и M, меченными вишней, показанными красным цветом, теперь может быть проверено.

Показанные здесь данные свидетельствуют о том, что абляция биполярных клеток запускает mullar ggl для замены утраченных клеток. Эта интерпретация согласуется с недавними исследованиями регенерации сетчатки, которые указывают на то, что Mueller Ggl является индуцированными травмами предшественниками как у млекопитающих, так и у рыб. Этот метод позволяет исследователям исследовать механизмы, регулирующие регенерацию определенных типов клеток с помощью визуализации стволовых клеток у рыбок данио.