G2-seq: Высокая пропускная способность на основе последовательности техника для выявления поздно репликации областей генома

Общая цель данной процедуры глубокого секвенирования ДНК из клеток, прошедших сортировку методом проточной цитометрии по фазе клеточного цикла, заключается в выявлении участков генома, которые реплицируются крайне поздно в клеточном цикле. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области репликации ДНК, например, какие области генома испытывают трудности при завершении репликации ДНК и, следовательно, особенно подвержены геномным перестройкам. Основным преимуществом данной техники является то, что, несмотря на ее простоту с экспериментальной точки зрения, она обеспечивает неожиданно детальное представление о динамике геномной репликации.

Для начала инокулируйте пробирки объемом 15 миллилитров, содержащие восемь миллилитров YEPD, интересующими клетками дрожжей. Допустимо использование синтетической или богатой среды. Культивируйте клетки в течение ночи (не менее 12 часов), чтобы собрать их в фазе истинного логарифмического роста.

На следующий день, когда плотность культур достигнет от 5 до 15 миллионов клеток на миллилитр, осадите клетки центрифугированием и ресуспендируйте их в 1,5 миллилитрах 70% ethanol. Затем перенесите суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 1,6 миллилитра и инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение одного часа или в течение как минимум трех часов на льду. После инокуляции осадите клетки центрифугированием и ресуспендируйте их в одном миллилитре цитрата натрия.

В завершение коротко дважды обработайте клетки ультразвуком. Затем повторите цикл центрифугирования и ресуспендируйте дрожжи в одном миллилитре цитрата натрия, содержащего RNase. Дайте RNase прореагировать с дрожжами при 50 °C в течение одного часа или в течение ночи при 37 °C в термоблоке или на водяной бане.

После обработки РНказой добавьте в смесь 50 µL раствора протеиназы K и продолжайте реакцию в течение одного часа при 50 °C. Затем осадите клетки центрифугированием и ресуспендируйте их в 1 mL цитрата натрия. Далее снова центрифугируйте клетки и удалите супернатант с помощью вакуумного аспиратора.

Затем при слабом освещении ресуспендируйте клетки в одном миллилитре цитрата натрия с красителем для нуклеиновых кислот зеленого цвета. Инкубируйте дрожжи в темноте в течение одного часа при комнатной температуре. Далее подсчитайте количество клеток с помощью клеточного сортера, используя данные эмиссии на 530 нанометрах.

Распределите их по фазам клеточного цикла (G1, S, ранняя G2 и поздняя G2) в соответствии с содержанием ДНК. Соберите не менее 1,6 млн гаплоидных клеток каждой фазы. Сразу после сортировки центрифугируйте клетки в течение 20 минут. Соберите супернатант и заморозьте осадок при температуре -20 °C для последующего хранения.

Мы обнаружили, что самым критическим этапом данной процедуры является своевременное осаждение клеток путем центрифугирования сразу после их сбора, максимум через час после сортировки. Данная экстракция основана на использовании набора для выделения геномной ДНК дрожжей. Начните с добавления 120 µL буфера для переваривания и 5 µL литического фермента для дрожжей.

Затем перемешайте клетки в реакционной смеси с помощью вортекса и инкубируйте смесь при 37 °C в течение 40–60 минут. Далее добавьте 120 µL лизирующего буфера и перемешайте смесь на вортексе на высокой скорости в течение 10–20 секунд. Затем добавьте 250 µL хлороформа и в течение одной минуты тщательно перемешайте содержимое пробирки.

Затем центрифугируйте пробирку на максимальной скорости в течение двух минут. После этого перенесите супернатант на колонку для связывания ДНК. Пропустите супернатант через колонку, используя один цикл центрифугирования на максимальной скорости в течение одной минуты.

Для промывки ДНК на мембране колонки перенесите колонку в новую пробирку для сбора и добавьте 300 µL буфера для промывки ДНК. Затем повторите центрифугирование на максимальной скорости в течение одной минуты. Повторите данный этап промывки еще один раз.

Для сбора ДНК перенесите спин-колонку в новую пробирку. Добавьте 60 µL воды и подождите от одной до трех минут. Затем центрифугируйте колонку на максимальной скорости в течение 10 секунд, чтобы изолировать воду, содержащую элюированную ДНК.

Теперь добавьте от 5 до 195 µL буфера для высокочувствительного анализа двухцепочечной ДНК, содержащего реагент в концентрации от 1:200. Затем измерьте флуоресценцию образца, чтобы рассчитать выход. Ожидаемое количество полученной ДНК составляет от 10 до 50 ng.

Теперь используйте соникацию, чтобы расщепить ДНК на фрагменты длиной от 250 до 350 пар оснований. Затем с помощью стандартного набора подготовьте библиотеку ДНК и секвенируйте ее, используя как минимум 10 миллионов одноконецных чтений длиной 50 пар оснований. Описанная процедура была использована для идентификации сайтов поздней репликации у budding yeast.

Нормальные клетки сравнивали с клетками, в которых отсутствовал Sir2 — белок-деацетилаза. В исходных данных наблюдались значительные пики, обусловленные главным образом наличием элементов TY. Эти пики были удалены путем ограничения глубины чтения до 2,5 кратного значения медианной глубины чтения для каждого образца.

Затем данные после удаления выбросов были сглажены с использованием скользящего окна размером 20 kb. Наконец, данные были нормализованы и представлены в виде отношений к уровням в фазе G1. Полностью нереплицированная клетка соответствовала бы значению 0,5, а полностью реплицированная — единице. В этих данных по седьмой хромосоме были обнаружены признаки известного региона поздней репликации у мутанта Sir2.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как определять области генома, в которых репликация ДНК завершается в последнюю очередь и которые, следовательно, особенно подвержены разрывам ДНК и другим проблемам, связанным с поздней репликацией.