G2-seq: Высокая пропускная способность на основе последовательности техника для выявления поздно репликации областей генома

Общая цель этой процедуры глубокого секвенирования ДНК из клеток, которые были отсортированы потоком в соответствии с фазой клеточного цикла, заключается в идентификации областей генома, которые реплицируются на очень поздних этапах клеточного цикла. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области репликации ДНК, например, какие участки генома испытывают трудности с завершением репликации ДНК и, следовательно, особенно уязвимы к перестройкам генома. Основное преимущество этого метода заключается в том, что, несмотря на свою простоту с экспериментальной точки зрения, он дает удивительно богатое представление о динамике геномной репликации.

Для начала закиньте 15 миллилитровые пробирки, содержащие восемь миллилитров YEPD, дрожжевыми клетками, представляющими интерес. Допустима синтетическая или насыщенная среда. Культивируйте клетки в течение ночи в течение не менее 12 часов, чтобы собрать их во время их реального логарифмического распределения фаз.

На следующий день, когда культуры достигнут плотности от 5 до 15 миллионов клеток на миллилитр, раскрутите клетки и повторно суспендируйте их в 1,5 миллилитрах 70% этанола. Затем переложите суспензию в микропробирку объемом 1,6 миллилитра и дайте клеткам инкубироваться при комнатной температуре в течение часа или не менее трех часов на льду. После инокуляции раскрутите клетки вниз и повторно суспендируйте их в одном миллилитре цитрата натрия.

Наконец, дважды кратко облучите клетки. Затем повторите цикл центрифугирования и повторно суспендируйте дрожжи в одном миллилитре цитрата натрия, содержащего РНКазу. Дайте РНКазе вступить в реакцию с дрожжами при температуре 50 градусов Цельсия в течение часа или в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в тепловом блоке или на водяной бане.

После обработки РНКазой добавьте в смесь 50 микролитров раствора протеиназы К и продолжайте реакцию в течение часа при температуре 50 градусов Цельсия. Затем раскрутите клетки вниз и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре цитрата натрия. Далее центрифугируйте клетки и аспирируйте надосадочную жидкость с помощью вакуума.

Затем при тусклом свете ресуспендируют клетки в одном миллилитре цитрата натрия с зеленым окрашиванием нуклеиновой кислоты. Теперь выдерживают в дрожжах в темноте в течение часа при комнатной температуре. Чтобы продолжить, подсчитайте ячейки с помощью сортировщика клеток по данным излучения 530 нанометров.

Отсортируйте их в соответствии с содержанием ДНК по фазам клеточного цикла: G1 S, ранний G2 и поздний G2. Соберите не менее 1,6 миллиона гаплоидных клеток из каждой фазы. Сразу после сортировки ячеек раскрутите их в течение 20 минут. Отсадите надосадочную жидкость и заморозьте гранулу при температуре минус 20 градусов Цельсия для хранения.

Мы обнаружили, что самым важным шагом в этой процедуре является простое вращение ячеек сразу после их сбора, максимум через час после сортировки. Эта экстракция основана на наборе для экстракции геномной ДНК дрожжей. Начните с добавления 120 микролитров буфера для пищеварения и пяти микролитров дрожжевого литического фермента.

Затем смешайте клетки с реакционной смесью с помощью вихря и инкубируйте смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение 40-60 минут. Далее добавьте 120 микролитров буфера для лизиса и перебейте смесь на высокой скорости в течение 10 – 20 секунд. Затем добавьте 250 микролитров хлороформа и в течение одной минуты тщательно перемешайте содержимое тюбика.

Далее крутите трубку на максимальных оборотах в течение двух минут. Затем перенесите надосадочную жидкость на ДНК-связывающую колонку. Прокрутите надосадочную жидкость через колонку, используя цикл центрифугирования с максимальной скоростью в одну минуту.

Чтобы промыть ДНК на мембране колонки, перенесите колонку в новую пробирку для сбора и нанесите 300 микролитров буфера для промывки ДНК. Затем повторите центрифугирование на максимальных оборотах в течение одной минуты. Повторите этот шаг стирки еще раз.

Чтобы собрать ДНК, перенесите спиновую колонку в свежую пробирку. Добавьте 60 микролитров воды и подождите одну-три минуты. Затем центрифугируйте колонку на максимальной скорости в течение 10 секунд, чтобы изолировать воду, содержащую элюированную ДНК.

Теперь добавьте от пяти до 195 микролитров двухцепочечного высокочувствительного буфера ДНК, содержащего реагент в концентрации от одного до 200. Затем измерьте флуоресценцию образца, чтобы рассчитать выход. Рассчитывайте собрать от 10 до 50 нанограммов ДНК.

Теперь используйте ультразвуковую терапию, чтобы разбить ДНК на фрагменты, которые содержат от 250 до 350 пар оснований. Затем используйте стандартный набор для подготовки библиотеки ДНК и секвенирования ее, используя не менее 10 миллионов 50 пар оснований для односторонних прочтений. Описанная процедура была использована для выявления поздно реплицирующихся сайтов в почковающихся дрожжах.

Нормальные клетки сравнивали с теми, в которых отсутствовал белок деацетилазы Sir2. Исходные данные содержали большие всплески, в основном из-за присутствия элементов TY. Эти всплески были удалены путем ограничения глубины считывания до 2,5 раз больше медианной красной глубины для каждого образца.

Затем данные были сглажены с помощью скользящего окна размером 20 КБ. Наконец, данные были нормализованы и построены в виде отношений к уровням в G1. Полностью нереплицированная клетка будет отображаться при 0,5, а полностью реплицированная клетка — при 0,5. В этих данных из седьмой хромосомы были обнаружены свидетельства известной поздней реплицирующейся области у мутанта Sir2

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как идентифицировать те участки генома, которые завершают репликацию ДНК последними и поэтому особенно уязвимы к разрывам ДНК и другим проблемам, связанным с поздней репликацией.