Совместимый с сканирующей электронной микроскопией оптический метод визуализации для мезоскопического картирования мозга в целых клеток

Наши исследования сосредоточены на коннектомике. Мы разрабатываем высокопроизводительные методы получения оптических или электронных изображений, позволяющие анализировать нейросхемы и особенности синаптической связности для расшифровки фундаментальной логики связей нейроцепей. Оригинальная коннектомика с высоким оборотом ограничена небольшими объёмами мозга из-за дорогостоящего сбора данных и точного, тогда как быстрый микроскопический анализ и целенаправленное микроскопическое исследование открывают потенциал для коннектомики всего мозга.

По сравнению с другими микроскопическими методами, такими как различные микроскопы Ларсена, OMLIT фиксирует изображения всех нейронов с помощью дендритов и аксонной информации. Помимо совместимости с электронным микроскопом, существует дополнительная наномасштабная визуализация в рамках EF. OMLIT помогает создавать комплексные модели мозга, отображая все дальние проекции, включая их направление, силу и тип, вместе с локальными микросхемами в сочетании с серийной тематикой. Он даёт представление о структурированной архитектуре и потоке информации во всём мозге.

Мы разрабатываем автоматизированную визуализацию OMLIT и сбор электромагнитных данных под руководством RI, определённых RI, что позволяет эффективно собирать и анализировать коннектомные данные на больших или целом мозге. Для начала выберите либо каптон, либо D50 пленку толщиной 50 микрометров, установленную на моторизованной обмотке. Используя систему распыления с двойной головкой магнетрона, на поверхность ленты нанесите равномерную тонкую пленку хрома или других металлов, таких как алюминий, серебро или медь.

Разместите ленту на расстоянии 80 миллиметров от мишени, распыляющейся. Выполняйте процесс при постоянном токе и при давлении в один паскаль, регулируемом 99,99% аргона. Теперь установите скорость намотки ленты на 0,6 миллиметра в секунду, чтобы получить толщину металлического покрытия 50 нанометров.

После осадки удалите ленту из системы, когда она остынет до комнатной температуры. Оценивайте толщину и однородность покрытия с помощью профилера стилуса, атомно-силовой микроскопии или сканирующей электронной микроскопии. Для стратегии низкой отражательной способности очистите и сделайте ленту гидрофильной с помощью плазменного очистителя мощностью 80 ватт, при этом двигайте ленту со скоростью семь миллиметров в секунду.

После обработки наместите капли воды на поверхность ленты, чтобы убедиться, что они быстро распространяются в тонкую пленку. С помощью небольшого шлифовального станка или аналогичного режущего инструмента грубо обрезайте смолу со стороны образца, чтобы удалить окружающую заготовку и открыть область образца. Поместите блок из смолы в держатель образца и затяните его, чтобы плотно закрепить блок.

Закрепите держатель образца на подвижном рычаге микротома. Установите стеклянный или алмазный нож под углом 45 градусов на держатель ножа. Под микроскопом обрежьте поверхность образца в форме пирамиды и сглаживайте её, затем обрежьте и сглаживайте четыре стороны блока образца, чтобы удалить избыточную смолу.

Поверните ручку, чтобы выровнять передние и задние края блока в горизонтальном положении. Снимите нож для обрезки и замените его алмазным ножом, установленным под углом 45 градусов. Установите угол наклона основания микротома на шесть градусов и медленно двигайте держатель ножа с помощью ручки, пока передний край ножа не окажется на расстоянии одного-двух миллиметров от поверхности образца.

Наблюдайте яркую полосу между поверхностью образца и лезвием ножа и регулируйте угол наклона, чтобы полоса была ровной сверху вниз и из стороны в сторону. Теперь введите дистиллированную воду в канавку алмазного ножа, чтобы смочить лезвие. Снимите немного воды с помощью шприца, пока уровень жидкости не снизится и отражение не станет серебристым.

Далее установите скорость резки толщиной сечения и окно резки в блоке управления. Отрегулируйте скорость сечения до 0,6 миллиметра в секунду и толщину сечения до 60 нанометров, в зависимости от качества образца. Начинайте секционирование с микротома.

Когда срезы будут стабильны и равномерны, процесс останавливается. Затем используйте тонкую щётку, чтобы удалить порезанные участки и мусор. Теперь установите и катушку с покрытым покрытием ленты, и пустую катушку на автоматическую систему сбора ультратонких секций.

Закрепите фиксирующий механизм и проведите пробный запуск, чтобы убедиться в плавном движении ленты на постоянной скорости и правильном сборе на катушку. Погрузите головку сбора заклеенного устройства в водяную ванну алмазного ножа и отрегулируйте головку так, чтобы она была параллельна краю ножа при длине ломка образца в 1,5 раза больше. Обезопасьте устройство для сбора и возобновите секционирование, одновременно запуская устройство для сбора ленты.

После сбора достаточного количества непрерывных секций приостановите секционное сечение. Отрежьте скотч в зоне без срезов. Запускайте устройство для сбора ленты, пока вся лента не будет намотана на катушку.

Затем снимите катушку и поставьте её в электронную сушильную духовку. Очистите устройство для сбора ленты и микротом и верните все аксессуары на свои места. Для крепления на силиконовую пластину отлепите прозрачную защитную пленку с двусторонней проводящей ленты.

Прикрепите ленту параллельно двусторонней проводящей ленте, размещая до трёх сегментов на каждую деталь. Разместите кремниевую пластину на сцене оптического микроскопа и закрепите её клейкой лентой без остатков. Используйте объектив 5X, чтобы получить обзорное изображение кремниевой пластины, ленты и образца.

На обзорном изображении обведите каждый участок и отсортируйте их, затем добавьте точки фокуса и экспозиции для автоматического увеличения 20 или 50 раз по всей пластине. После съёмки сохраните изображения и проверьте их качество, перефокусируйте и повторно сфотографируйте, если что-то не в фокусе или качество плохое. Импортируйте стек изображений TIFF в VAST 22, выбрав импорт, затем импорт тома изображения из изображений в VSV-файл.

Подключите внешний планшет и используйте инструмент кисти и режим рисования сегментов, чтобы вручную сегментировать и обводить структуры. Используйте клавиши ярлыков A и Z для навигации между срезами изображения. Теперь визуализируйте сегментированную структуру в трёх измерениях, выбрав окно, затем 3D-просмотр, просмотр и обновление.

Наконец, сохраните результаты сегментации после выбора файла и сохраните сегментацию. На изображениях с высокой отражательной способностью цитоплазматический и сосудистый просветы показали более высокую интенсивность по сравнению с окружающими, тогда как на изображениях с низкой отражательной способностью цитоплазматический и сосудистый просветы — более интенсивные. Количественные результаты показали, что стратегии с высокой и низкой отражательностью.

Каждый из них имел преимущества с точки зрения контраста и информационной энтропии. Оптическая микроскопия OMLIT позволила идентифицировать аксоны, кровеносные сосуды, клеточные тела и дендриты. Ручная сегментация изображений омлетов с использованием VAST показала множество плотно расположенных клеточных тел, дендритов и аксонов.

Сегментированные результаты были объединены с оригинальным изображением для получения трёхмерной визуализации. Увеличенные изображения OMLIT показали недостаточное разрешение для выявления более тонких структур. Изображения электронной микроскопии того же региона выявили синапсы, митохондрии, ядра клеток и везикулы.