Confocal микроскопии показывает клеток поверхности рецептор агрегации через спектроскопии корреляции изображений

Общая цель данного протокола корреляционной спектроскопии изображений заключается в том, чтобы предоставить доступную методологию количественной оценки событий кластеризации, происходящих на поверхности клетки. Антитела, которые связываются с рецепторами на поверхности клетки, могут давать подтверждение и кластерные изменения. Анализ этих динамических процессов важен для определения характеристик мишеней для лекарственных препаратов.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обеспечивает доступную методологию количественной оценки событий кластеризации на поверхности клетки с использованием легкодоступной аппаратуры визуализации. Для начала посадите 10 000 клеток эпидермоидной карциномы A431 в каждую лунку восьмикамерного предметного стекла. На следующий день добавьте 100 нанограммов на миллилитр лиганда EGF непосредственно в клетки, чтобы стимулировать агрегацию рецепторов EGF.

Инкубируйте клетки с лигандом при комнатной температуре в течение 10 минут перед их фиксацией. Затем следуйте протоколу иммуноцитохимии и конфокальной визуализации в сопроводительном текстовом протоколе, уделяя особое внимание настройкам, используемым во время сбора, и загрузите полученные наборы данных на Фиджи. Необходимо избегать перенасыщения.

Итоговые изображения должны содержать размер пикселя менее 1 микрона в квадрате. Кроме того, захватите плоскую поверхность на апикальной или базальной поверхности, а также безклеточную область для последующей нормализации образца. Начните с определения области апикальной или базальной мембраны поверхности клетки, представляющей интерес на первом изображении.

Выберите размер пикселя от 2 до n в диапазоне 256 x 256, 128 x 128 или 64 x 64. Затем перейдите в меню изображения и выберите «Дублировать». Далее переходим к анализу, и спускаемся к измерениям.

Рассчитайте среднюю интенсивность обрезанной области интереса. Теперь определите область фона того же размера, что и исходное изображение. Скопируйте его, как и раньше.

И рассчитаем среднюю интенсивность фоновой обрезанной области интереса. Измерив область интереса и фон, перейдите в процесс и выберите калькулятор изображений. Поместите область интереса как Изображение 1, а фоновое изображение как Изображение 2 и выберите Вычесть в качестве операции.

Далее переходим в меню процесса. Перейдите в раздел БПФ и выберите FD Math. В диалоговом окне математических операций БПФ выберите Введите изображения, как показано ниже, и установите для операции корреляцию.

Убедитесь, что обратное преобразование включено. Нормализуйте полученное изображение, выбрав процесс, прокрутив вниз до математики, выбрав «Разделить» и введя общее количество пикселей в диалоговое окно. Затем снова нормализуйте, разделив на среднюю интенсивность нормализованной подрезанной площади в квадрате.

Далее проведите линию через функцию распределения точек. Постройте профиль этой линии, чтобы рассчитать пиковое значение, перейдя в раздел анализ, и выбрав профиль графика. Рассчитайте кластеры на площадь луча путем переноса пикового значения в таблицу.

Затем установите кластеры на площадь луча равными единице над пиковым значением минус один. Для пакетной обработки изображений рекомендуется установить макрос Фиджи. Это позволяет проводить последовательный и быстрый анализ множественных конфокальных изображений для корреляционного спектроскопического анализа изображений.

Чтобы установить макрос для рабочего процесса корреляционной спектроскопии изображений, настройте программу на запись каждой команды меню в протоколе. Для этого перейдите в раздел Plugins, опуститесь до marcos и выберите Record. Затем вернитесь в главное окно и выполните протокол, описанный в предыдущем разделе этого видео.

По завершении вернитесь в окно макроса и нажмите кнопку Создать, чтобы создать макрос. Далее в окне редактирования макроса обязательно выберите язык в качестве макроса LJ1. Если этот вариант не выбран, программа не сможет запуститься.

Наконец, сохраните макрос. Функция оптического переноса микроскопа гарантирует, что даже молекулярные объекты выглядят как изображения на расстоянии от 200 до 300 нанометров в плоскости XY. Визуализируя гранулы фрезина с субразрешением таким же образом, как это описано в данном протоколе, можно рассчитать площадь функции разброса точки микроскопа.

Эти изображения представляют собой стимулированные EGF и несимулированные адгезивные клетки эпидермоидной карциномы A431, меченные первичным антителом цетуксимаба, нацеленным на рецептор EGF клеточной поверхности. Желтые прямоугольники представляют собой клеточную мембрану, содержащую области культуры с размерами 64 на 64 пикселя. Эти изображения были использованы для проведения корреляционного спектроскопического анализа изображений.

После нормализации автокорреляционной функции функция точечного спреда может быть измерена с помощью линейного инструмента. Профиль этой линейной функции строится для определения пикового значения. С помощью этих методов было обнаружено, что стимуляция EGF индуцировала уменьшение в 2,56 раза обнаруженных кластеров EGFR на площадь пучка по сравнению с нестимулированными клетками.

После освоения анализ конфокальных изображений займет всего несколько минут на одно изображение. При попытке выполнить эту процедуру важно собрать несколько повторений каждого экспериментального условия с использованием настроек, описанных в этом протоколе. После этой процедуры корреляционная спектроскопия изображений может быть расширена для изучения временных изменений событий кластеризации в живых клетках с помощью покадровой микроскопии.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям к исследованию состояний агрегации более высокого порядка с использованием фотообесцвечивающей ICS и совместной локализации двух мембранных белков с использованием методологий спектроскопии изображений с перекрестной корреляцией. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как рассчитать состояние кластеризации интересующей вас молекулы клеточной поверхности.