Вариации на отрицательной пятно методы электронной микроскопии: инструменты для решения сложных систем

Общая цель этого видео — продемонстрировать несколько различных вариантов методов получения образцов с помощью электронной микроскопии с отрицательным окрашиванием. Отрицательное окрашивание – лучший способ быстрой оценки качества ЭМ-пробы. Важно понимать, что для некоторых образцов лучше подходят различные методы подготовки сетки.

Метод, который лучше всего подходит для любого конкретного образца, должен быть определен методом проб и ошибок. Для начала подготовьте ЭМ-сетки методом углеродного листа и приготовьте реагенты для отрицательного окрашивания, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Поместите ЭМ-сетку с углеродным покрытием вверх на предметное стекло микроскопа.

Установите предметное стекло в блок тлеющего разряда и обрабатывайте сетку не менее 30 секунд при давлении 10 миллиампер, чтобы сделать сетку гидрофилизированной. По окончании извлеките пробу из разгрузочного блока. Затем с помощью пинцета с отрицательным давлением ухватитесь за край сетки.

Чтобы окрашивать методом боковой блотки, сначала нанесите на опорную поверхность три-пять микролитров образца. Дайте образцу адсорбироваться на поверхности сетки в течение от 10 секунд до одной минуты, затем прикоснитесь краем сетки к листу фильтровальной бумаги и позвольте капиллярному действию удалить жидкость. Далее поместите 50 микролитров капель сверхчистой воды или соответствующего летучего буферного раствора на лист лабораторной пленки.

Аккуратно коснитесь карбоновой поверхностью сетки до капли и снимите маленькую каплю с поверхности сетки. Затем прикоснитесь краем сетки к листу фильтровальной бумаги и позвольте капиллярному действию удалить жидкость. Далее поместите две капли по 50 микролитров красящего реактива на лист лабораторной пленки.

Осторожно коснитесь карбоновой поверхности сетки до капли и снимите небольшую каплю с верхней поверхности сетки. Если пятно мигрирует на заднюю часть сетки, значит, углеродная пленка была нарушена и ее необходимо выбросить. Через 10-15 секунд прикоснитесь краем сетки к листу фильтровальной бумаги и позвольте капиллярному действию вытянуть жидкость.

Повторите этот шаг окрашивания еще раз, а затем дайте сетке высохнуть на воздухе. Чтобы окрасить образец методом перелистывания, возьмитесь за край сетки пинцетом с отрицательным давлением и нанесите от трех до пяти микролитров образца на опорную поверхность. Держа пинцет в одной руке, наклоните сетку так, чтобы она была примерно под углом 45 градусов в сторону, и быстро проведите запястьем, чтобы стряхнуть большую часть капли, которая находится на верхней части сетки.

Затем с помощью стеклянной пастеровской пипетки нанесите каплю моющего раствора на опорную поверхность. Смахните каплю и повторите несколько раз, чтобы смыть образец. Далее нанесите каплю окрашивающего реагента на опорную поверхность и снова смахните каплю.

Повторите этот шаг окрашивания от одного до трех раз, в зависимости от глубины окрашивания, которая требуется для визуализации образца. Удалите излишки пятна, прикоснувшись порванным краем листа фильтровальной бумаги к краю сетки, а затем дайте сетке высохнуть на воздухе. Чтобы окрасить образец методом быстрой промывки, сначала наберите от 30 до 70 микролитров красителя на кончике пипетки объемом 200 микролитров.

Поверните регулятор громкости, чтобы набрать пять микролитров воздуха, затем наберите от пяти до 30 микролитров промывочного реагента, а затем еще один небольшой воздушный зазор, прежде чем набрать еще пять микролитров образца. Возьмитесь за край сетки пинцетом с отрицательным давлением и наклоните сетку примерно на 45 градусов в сторону. Одним быстрым движением вытолкните все содержимое наконечника пипетки по лицевой стороне электромагнитной решетки с углеродным покрытием.

Удалите излишки пятна, прикоснувшись к оторванному краю листа фильтровальной бумаги к краю сетки, и дайте сетке высохнуть на воздухе. Идеальный выбор для отрицательного окрашивания сильно зависит от образца. Наиболее часто используемым морилкой является уранилацетат, но также можно использовать лантаноидные красители.

Для глубоко внедренных образцов красители на основе лантаноида, ацетат тулия и ацетат эрбия, вызывали отрицательное окрашивание эквивалентного качества уранилацетату, если судить по кажущемуся контрасту и резкости окрашенных частиц, при этом ацетат тулия давал более четкие и четкие изображения, чем ацетат эрбия. Большой размер зерен ацетата тулия становится очевидным при большом увеличении, что показано здесь, когда образец волокнистых частиц табачной мозаики был окрашен 1% ацетатом тулия. При использовании ацетата тулия на глаз хорошо виден 23-ангстремовый повтор волокнистой частицы табачной мозаики.

Ни один из других протестированных лантаноидных красителей не смог устранить эту особенность. Еще одним трудным для визуализации образцом является мышечный С-белок. Этот образец дает значительно отличающиеся изображения в зависимости от метода окрашивания.

При окрашивании методом боковой блоттинга он выглядит как шаровидная, свернутая крыловидная структура. Когда сетки готовятся методом перелистывания, белок C наблюдается в виде ряда доменов, напоминающих бусины на нитке. Это лучше отражает фактическую структуру белка С.

После освоения требуется всего около минуты, чтобы подготовить образец с негативным окрашиванием. Важно помнить, что каждый образец по-разному реагирует на каждую технику окрашивания. Для новых образцов наилучший подход должен быть определен экспериментально.

Не забывайте, что окрашивающие уранил реагенты токсичны и слабо радиоактивны. Убедитесь, что они утилизированы в надлежащем потоке отходов.