При содействии формальдегида изоляции нормативных элементов для измерения доступности хроматина в клетках млекопитающих

Общая цель этого эксперимента заключается в определении доступности хроматина в генетическом локусе путем ковалентного сшивания ДНК с ассоциированными белками с последующей очисткой и количественной оценкой свободной ДНК. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области хроматина, поскольку доступность ДНК может быть определена независимо от типа клеток в необработанных клетках, а также в клетках, подвергающихся ремоделированию хроматина. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она не требует использования ферментов для расщепления ДНК или антител, которые необходимо титровать для каждой экспериментальной установки.

Этот протокол имеет дополнительное преимущество, заключающееся в том, что он не требует никакого специального оборудования, кроме ультразвукового аппарата. Демонстрировать процедуру будут Олеся Риттер и Табеа Ридлингер, аспиранты моей лаборатории. Чтобы начать протокол, добавьте формальдегид непосредственно в питательную среду клеток, которые были посеяны за день до этого, чтобы достичь конечной концентрации 1% по объему.

Инкубируйте среду в течение 10 минут при комнатной температуре и переворачивайте пластины вручную каждые две минуты. Затем добавьте глицин до конечной концентрации 0,125 моляра, чтобы погасить формальдегид. Инкубируйте раствор в течение пяти минут при комнатной температуре и перебивайте его каждые две минуты.

Отсадите среду, а затем осторожно добавьте ледяной PBS на бортик посуды, чтобы промыть клетки. Отсадите среду и тщательно повторите промывку дважды. После третьего промывки повторно суспензируйте клетки в одном миллилитре ледяного PBS и при необходимости используйте скребок для клеток, чтобы отделить клетки.

Переложите их в реакционную пробирку объемом 1,5 миллилитра на льду. Центрифугируйте ячейки в течение пяти минут при 300 г и четырех градусах Цельсия в охлаждаемой настольной центрифуге. Осторожно аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость.

Повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре буфера для лизиса FAIRE, тщательно пипетируя вверх и вниз несколько раз. Инкубируйте клетки в течение 20 минут на льду. После инкубации ультразвуком обеспечьте сшитую ДНК, чтобы довести ее до среднего размера от 200 до 300 пар оснований, и охладите образцы во время ультразвуковой обработки, чтобы избежать нагрева образца.

Фрагментация ДНК имеет решающее значение для этого эксперимента, поскольку размер фрагментов влияет на чувствительность раствора всей техники, поэтому важно заранее тщательно определить условия ультразвуковой обработки и проверять размер фрагментов хроматина в каждом отдельном эксперименте. Центрифугируйте образец в течение 15 минут и 13 000 г при четырех градусах Цельсия. Затем перенесите надосадочную жидкость в новую реакционную трубку.

Разделите образцы на 100 микролитров аликвот. Используйте аликвоту объемом 100 микролитров для обратного сшивки и использования в качестве эталона для общего анализа ДНК. Добавьте 10 микролитров РНКазы А и инкубируйте образец в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем добавьте 10 микролитров протеиназы К. Используйте программируемый термоблок для инкубации образца в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия, а затем в течение шести часов при температуре 65 градусов Цельсия, чтобы расщепить белки и обратить вспять поперечные сшивки. Получите новую, 100 микролитровую аликвоту, добавьте 10 микролитров РНКазы А и инкубируйте образец в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации продолжайте работу с несшитым образцом и несшитым образцом из предыдущего участка параллельно.

Добавьте H2O, чтобы получить конечный объем в 300 микролитров. Затем добавьте 300 микролитров фенола хлороформа, изоамилового спирта в вытяжной шкаф и энергично перемешайте. Центрифугируйте образцы в течение 10 минут при 13 000 г и четырех градусах Цельсия.

Далее осторожно переложите 280 микролитров верхней водной фазы в новую реакционную пробирку. Убедитесь, что вы не забираете мусор из интерфазы, который также содержит белки, и выбрасывайте оставшуюся более низкую фазу как отходы органических растворителей. Повторите обработку и осторожно перенесите 270 микролитров верхней водной фазы в новую реакционную пробирку.

Добавьте 270 микролитров хлороформа в вытяжной шкаф и энергично перемешайте. Центрифугируйте образец. После центрифугирования осторожно перенесите 250 микролитров верхней водной фазы в новую реакционную пробирку, стараясь не унести мусор из интерфазы.

Выбросьте оставшийся образец как отходы органических растворителей. Затем добавьте 25 микролитров пяти моляров хлорида натрия, 250 микролитров изопропанола и добавьте пять микролитров гликогена в качестве носителя ДНК. Переверните трубки и инкубируйте их при комнатной температуре.

После инкубации центрифугируйте образец для осаждения ДНК. Далее промойте гранулу ДНК 400 микролитрами 70% объемного этанола и центрифугируйте образец. Осторожно отсадите надосадочную жидкость и дайте грануле высохнуть в течение 10 минут при комнатной температуре.

Как только гранула высохнет, снова суспендируйте ее в 100 микролитрах TE-буфера. Инкубируйте образец свободной ДНК без расщепления в течение четырех часов при температуре 65 градусов Цельсия для удаления сшивок между ДНК. Наконец, количественно определите количество ДНК с помощью спектрофотометра и запустите небольшую аликвоту, чтобы проверить размер фрагмента агарозного геля с весом 2% по объему.

Клетки HeLA стимулировали TNF в течение одного часа и анализировали с помощью FAIRE. Соотношение между свободной и общей ДНК было определено для промотора ACTB, гена, кодирующего бета-актин и положительный контроль, гетерохроматиновой области на хромосоме 12, отрицательного контроля и промотора IL8. Был получен окрашенный бромидом этидии гель с различным временем ультразвука, который указывает на то, что оптимальный размер хроматина от 200 до 300 пар оснований был получен после 20 минут ультразвуковой обработки.

После освоения этой техники ее можно сделать за два дня. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как глубокое секвенирование, чтобы определить доступность хроматина на уровне всего генома. Не забывайте, что работа с формальдегидом и фенолхлороформом может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры следует обеспечить такие меры предосторожности, как работа в вытяжном шкафу, ношение перчаток и надлежащая утилизация отходов.