Определение уровня выражения протеина в культивируемых клеток Immunocytochemistry на клетки, парафин врезанных блоков

Общая цель этой процедуры заключается в анализе экспрессии интересующих маркеров пролиферации с помощью иммуноцитохимического и гистологического анализов тромбопластин-плазматических клеточных блоков залитых сгустков ткани. Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос о клинической патологии блокирования клеток тканями. Основным преимуществом данного альтернативного метода иммуноцитохимического анализа залитых парафином клеточных блоков является техническая простота процедур.

Когда 100-миллиметровая чашка с культурой клеток HeLa достигнет конфлюенции, замените надосадочную жидкость 10 миллилитрами среды для культивирования клеток HeLa без FBS и верните чашку в инкубатор для клеточных культур. Через 48 часов промойте клетки двумя миллилитрами PBS с последующей инкубацией в двух миллилитрах 0,25% ЭДТА плюс трипсин в течение двух-трех минут при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе. Когда клетки разъедутся, прекратите реакцию пятью миллилитрами полной среды и переложите клеточный раствор в коническую пробирку объемом 15 миллилитров.

Соберите клетки центрифугированием с последующим проведением двух промывок в двух миллилитрах холодной PBS за промывку. После второй стирки замените надосадочную жидкость на один миллилитр 95%-ного этанола и перемешайте гранулу путем вортексирования. Затем поместите неподвижные ячейки на лед.

Чтобы приготовить парафиновый клеточный блок, после сбора плазмы ЭДТА из здоровой донорской крови центрифугируйте образцы и перенесите от 200 до 400 микролитров аликвот надосадочной плазмы в отдельные микрофуговые пробирки. Далее добавьте около 200 микролитров плазмы, около 200 микролитров тромбопластина и около 200 микролитров 025 молярного хлорида кальция к фиксированным клеткам HeLa. Дайте смесям образовать сгустки клеток при комнатной температуре в течение десяти минут, затем промойте сгустки два раза одним миллилитром PBS, полностью сцедив сгустки на отдельные кусочки смоченной формалином фильтровальной бумаги после второй стирки.

Заверните сгустки в фильтровальную бумагу и с помощью набора булавок поместите салфетки в отдельные кассеты для салфеток в центре четырех других листов бумаги, смоченной формалином. Затем поместите тканевые кассеты в стеклянные банки, содержащие 50 миллилитров буферного формалина для ночной фиксации формалина при четырех градусах Цельсия. На следующее утро загрузите кассеты в тканевый процессор для удаления воды в течение ночи и кондиционирования фиксированных клеток.

Не менее чем за час до окончания процедуры обработки включите нагретую закладочную станцию для расплавления парафина. Когда станция заделки и сгусток будут готовы, подтвердите наличие расплавленного парафина в металлической форме и перенесите сформированный сгусток ячеек в парафин. Поместите новую кассету для салфеток без крышки в металлическую форму и накройте кассету еще расплавленным парафином.

Дайте парафину застыть в холодной тарелке в течение 30-60 секунд. Затем отделите тканевую кассету от металлической формы. Чтобы подготовить срезы для иммуноцитохимического анализа, расположите сгусток клеток в одном парафиновом клеточном блоке и с помощью микротома разрежьте блок на ломтики толщиной от трех до четырех микрометров.

Поместите парафиновые срезы на стеклянные предметные стекла, покрытые солевым раствором, и поместите горки в духовку при температуре 37 градусов Цельсия на 30 минут. После того как срезы прилипнут к предметным стеклам, депарафинизируйте стекла в 15 миллилитрах ксилола в течение четырех минут с последующим обезвоживанием срезов с помощью последовательной двухминутной нисходящей инкубации этанола. После инкубации 80%-ным этанолом промойте срезы в проточной воде в течение 10 минут и отварите предметные стекла в банке, содержащей 40 миллилитров буфера для извлечения трис-ЭДТА, в течение 30 минут.

В конце инкубации промойте полученные антигеном предметные стекла под проточной водой, а затем проведите 10-минутную инкубацию в 95% этаноле при четырех градусах Цельсия. После сушки на воздухе используйте гидрофобную ручку, чтобы обвести область окрашивания клеток на каждом предметном стекле. Промойте предметные стекла в TBS-T с последующей инкубацией в блоке перекиси водорода в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы удалить остатки активности пероксидазы.

Промойте предметные стекла три раза в TBS-T в течение двух минут при каждом мытье, затем пометьте срезы 100 микролитрами первичной смеси антител из интересующего набора иммуноцитохимических красителей в течение одного часа, а затем промывайте их пятью двухминутными TBS-T. После последней промывки инкубируйте предметные стекла в первичном усилителе антител из набора в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. В конце инкубации срезы четыре раза промыть в TBS-T, добавив около 200 микролитров вторичного антитела, меченного пероксидазой хрена, после последней промывки в течение 30-минутной инкубации при комнатной температуре.

Усиленные срезы промыть пять раз в свежем ТБС-Т с последующим добавлением 100 микролитров раствора даминобензидина на срез в течение трех минут. Вымойте слайды два раза в TBS-T и промаркируйте срезы 100 микролитрами раствора гематоксилина в течение одной минуты. Затем промойте предметные стекла еще раз в TBS-T и инкубируйте предметные стекла в 95% этаноле в течение двух минут, после чего следует одно погружение в свежий 95% этанол и два погружения в 100% этанол.

Инкубируйте обезвоженные секции этанола в 40 миллилитрах ксилола в стеклянной банке в течение пяти минут и дайте предметным стеклам высохнуть на воздухе. Затем закрепите крышку на каждом предметном стекле и наблюдайте за образцами под световым микроскопом. Окрашивание гематоксилином и эозином залитой парафином ткани, как только что было продемонстрировано, обнаруживает в основном тактовые ядра и цитоплазму, что свидетельствует об отличной морфологической сохранности образцов клеток с помощью этого метода.

Однако плохо подготовленные клеточные блоки демонстрируют плохую морфологию и нерегулярную маркировку, даже если образцы окрашены должным образом. Второй ассоциированный белок цитоскелета обычно наблюдается в конденсированном хроматине, митотическом веретене и цитоплазме. Только клетки с окрашиванием второго белка, связанного с цитоскелетом, в конденсированном хроматине являются митотическими клетками, в то время как в популяции культуры клеток HeLa, испытывающей сывороточный голод, обнаруживается небольшое количество положительных клеток, ассоциированных с цитоскелетом.

Большинство высокомитотических клеток HeLa также являются Ki-67-положительными, и окрашивание Ki-67 наблюдается в ядрах клеток. Только около половины клеток HeLa, испытывающих сывороточный голод, экспрессируют этот маркер пролиферации. После освоения этой техники ее можно выполнить за шесть часов, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о разбавлении клеток до соответствующей плотности для создания хорошего тромба. После этой процедуры может быть выполнен другой метод, такой как проточный цитометрический анализ фиксированных клеток, чтобы ответить на дополнительный вопрос о фазе клеточного цикла во время синхронизации. После своего развития этот метод проложил путь к будущему в области патологии печени для изучения профилирования экспрессии в клеточной линии с сохранением морфологической информации в культивируемых клетках.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить иммуноцитохимию и готовить блоки тромбопластина плазмы из культивируемых клеток. Не забывайте, что работа с опасными реагентами, такими как ксилол, может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и лабораторного халата.