Использование двух мерных полу денатурируя стирального геля агарозы подтвердить размер неоднородность волокон амилоида или амилоид как

Общая цель этого двумерного электрофореза в виде денатурирующего детергента агарозного геля заключается в подтверждении неоднородности размеров амилоидных или амилоиподобных волокон, наблюдаемой во время традиционного SDD-AGE. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области амилоида или агрегации белков, например, является ли размерная гетерогенность, наблюдаемая во время традиционного SDD-AGE, нативным состоянием волокон in vivo или результатом деградации белка или диссоциации во время гель-электрофореза. Основным преимуществом этой методики является то, что ее можно легко выполнить в лаборатории без специального оборудования.

Не требуется никакого дополнительного оборудования, кроме того, которое используется в традиционном SDD-AGE. Во-первых, посейте амилоид-продуцирующие клетки рака толстой кишки HT-29 в 10-сантиметровую чашку для культивирования тканей. Затем инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.

Как только клетки достигнут 80% конфлюенции, используйте фосфатно-солевой буфер для промывания клеток. Затем добавьте в клетки три миллилитра трипсина, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех минут. После того как клетки отсоединились от чашки для культивирования, добавьте в тарелку 10 миллилитров питательной среды.

Затем переложите клеточную суспензию в 15-миллилитровую коническую трубку. Затем центрифугируйте клеточную суспензию при 1000 умноженных на g в течение трех минут при комнатной температуре. После центрифугирования аспирируйте среду и повторно суспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах питательной среды.

Подсчитайте ячейки с помощью счетчика ячеек. Затем оставьте две культуральные пластины при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. Далее добавьте реактивы ТСЗ в одну из посуды для культуры в качестве обработки.

Примерно через шесть часов соберите клетки с помощью пластикового скребка. Затем переложите клеточную суспензию в 15-миллилитровую коническую пробирку и центрифугируйте при 1000 умноженных на g в течение трех минут при четырех градусах Цельсия. Затем дважды промойте клеточную гранулу 10 миллилитрами ледяного фосфатно-солевого буфера и повторите процесс центрифугирования.

Далее аспирируйте раствор PBS и переложите клеточную гранулу в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Добавьте в клеточную гранулу 0,3 миллилитра буфера для лизиса, и инкубируйте на льду в течение 30 минут. Снова центрифугируйте при 20 000 умноженных на g в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.

Полученный надосадочный слой представляет собой лизат всей клетки. К надосадочной жидкости добавьте 4X SDD-AGE буфер для приготовления 20 микролитров по три микрограмма на микролитр образца. Инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 10 минут.

Чтобы приготовить гель, добавьте два грамма порошка агарозы в 200 миллилитров буфера TAE в стеклянный стакан. Затем нагрейте стакан в микроволновой печи, чтобы агароза расплавилась. Затем добавьте один миллилитр 20% SDS до конечной концентрации 0,1%.

Далее вылейте жидкую агарозу на гелевую плиту размером 15 на 14 сантиметров. Чтобы удалить пузырьки воздуха, используйте пипетку объемом в один миллилитр. Затем нанесите на гель расческу на 20 лунок.

Затем добавьте примерно 60 микрограммов лизата цельных клеток в крайнюю правую полосу геля. Запустите гель при напряжении 60 вольт в течение примерно четырех часов, используя буфер TAE, содержащий 0,1% SDS, в качестве рабочего буфера. Чтобы запустить гель во втором измерении, осторожно поверните гель на 90 градусов против часовой стрелки.

Затем запустите гель при напряжении 60 вольт в течение примерно четырех часов. В емкость размером 20 на 20 сантиметров добавьте 500 миллилитров буфера для переноса. Сразу же рядом с контейнером подготовьте стопку бумажных полотенец высотой пять сантиметров.

Затем смочите две фильтровальные бумаги, каждая размером 14 на 15 сантиметров, в буфере для переноса и положите поверх стопки бумажных полотенец. Активируйте мембрану из ПВДФ размером 14 на 15 см в метаноле на 30 секунд. После активации поместите мембрану поверх фильтровальной бумаги и с помощью валика удалите все пузырьки.

Самая важная часть переноса – убедиться, что между гелем и мембраной не образуются пузырьки воздуха. Смойте гель с помощью буфера для переноса и нанесите его поверх мембраны. Раскатайте все образовавшиеся пузыри.

Затем используйте полиэтиленовую пленку, чтобы накрыть край бумажных полотенец, ближайший к контейнеру для переноса буфера. Затем смочите в буфере для переноса лист фильтровальной бумаги размером 15 на 35 сантиметров. Поместите фильтровальную бумагу таким образом, чтобы один конец закрывал верхнюю часть геля, а другой конец находился в контейнере для трансферного буфера.

Накройте контейнер полиэтиленовой пленкой, и оставьте на ночь при комнатной температуре. На следующий день промойте мембрану 50 миллилитрами PBST в емкости размером 20 на 20 сантиметров. Далее добавьте 20 миллилитров 5%-ного молока в PBST на мембрану.

Затем оставьте мембрану на коромысле при комнатной температуре на 30 минут для блокировки. Пипеткой 10 микролитров антител кролика против MLKL в 20 миллилитрах 5%-ного молока в PBST. Затем добавьте смесь антител на мембрану.

Инкубируйте мембрану на коромысле на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. Затем промойте мембрану 20 миллилитрами PBST в течение пяти минут. Такую стирку повторяют пять раз.

Затем пипеткой внесите четыре микролитра антител против HRP кролика в 20 миллилитров 5%-ного молока в PBST. Добавьте антитело на мембрану. Оставьте емкость с мембраной на коромысле при комнатной температуре на два часа.

Через два часа промойте мембрану пять раз в 20 миллилитрах ПБСТ по пять минут каждый. Наконец, добавьте на мембрану подложку с усиленной хемилюминесценцией. Затем подвергните мембрану воздействию рентгеновской пленки в соответствии с инструкциями производителя.

Данное исследование проводится с целью демонстрации наличия устойчивых к SDS амилоидоподобных волокон в лизатах цельных клеток, полученных из клеток, обработанных фактором некроза опухоли альфа. Это показывает, что RIPK1 и RIPK3 демонстрируют схожие идентичные амилоидные паттерны. Интересно, что волокна MLKL кажутся неоднородными с другим характером миграции, чем другие.

На этом изображении показана возможная миграция амилоидных или амилоиподобных волокон. В первом измерении SDD-AGE амилоидные или амилоиподобные волокна демонстрируют характерный мазок. На этом изображении волокна мигрируют идентично во втором прогоне и демонстрируют диагональную схему миграции на мембране под углом 45 градусов.

Это показывает, что волокна не подвергаются деградации или диссоциации в процессе протекания геля. Напротив, если волокна диссоциируют, то ниже диагональной линии появляются вертикальные полосы, что указывает на более быструю миграцию более мелких волокон во время второго электрофореза. Как первое, так и второе измерения SDD-AGE показывают, что волокна MLKL не диссоциируют в процессе SDD-AGE и действительно отличаются от волокон RIPK1 и RIPK3.

На этом изображении волокна MLKL имеют характерный мазок во время первого измерения. Тем не менее, те же волокна демонстрируют четкую диагональную линию без вертикальных полос во втором измерении SDD-AGE. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что все условия, такие как напряжение и длина прогона, остаются неизменными между первым и вторым измерениями, чтобы обеспечить четкую линию под углом 45 градусов.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как удаление мембраны и повторное зондирование другими антителами, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, содержит ли волокно другие белки. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как подтвердить, что при традиционном SDD-AGE не происходит деградации или диссоциации амилоидных или амилоидных волокон.