Цифровая ПЦР на основе чипа для выявления редких вариантов транскриптов с помощью нанофлюидного чипа

Метод цифровой ПЦР на основе чипа разделяет одну реакцию на камеры наножидкого чипа. Амплификация разделенных последовательностей позволяет обнаруживать редкие варианты транскриптов — неканонические транскрипты, встречающиеся с низкой частотой.

Для начала возьмите образец, содержащий кДНК целевого редкого варианта транскрипта и общего варианта. Добавьте раствор, содержащий термостабильную ДНК-полимеразу, dNTP и праймеры.

Добавьте распространенные и редкие олигонуклеотидные зонды, специфичные для вариантов транскриптов, помеченные различными флуоресцентными репортерами и молекулами гасителя. Гаситель поглощает флуоресценцию репортера, когда находится в непосредственной близости.

Загрузите смесь на нанофлюидный чип. Решение разделено на нанокамеры одинакового размера. Каждая камера, содержащая кДНК, служит самостоятельным реакционным сосудом.

Запустите процесс термоциклирования. Высокая температура денатурации разделяет двухцепочечную ДНК на одинарные нити. Уменьшите температуру, что позволит праймерам и олигонуклеотидным зондам отжигать комплементарные участки на отдельных цепях ДНК.

Увеличьте температуру, чтобы достичь стадии удлинения, когда ДНК-полимераза удлиняет праймер и расщепляет зонд. Расстояние от гасителя позволяет репортеру излучать флуоресценцию. Считывание сигнала флуоресценции.

Создайте точечную диаграмму, изображающую камеры с амплицированной мишенью с редким транскриптом и камеры без цели. Положительные сигналы для мишени указывают на наличие в образце варианта с редким транскриптом.

Для начала дайте мастер-смеси и анализу оттаять при комнатной температуре не менее 20 минут. Затем загрузите 0,5-миллилитровые пробирки с 6-микролитровыми аликвотами образцов кДНК. Кроме того, сделайте контрольную трубку без шаблона. Далее аккуратно перемешайте мастер-смесь и аликвоту 8,7 микролитров за реакцию в стерильную пробирку.

Затем для каждой реакции добавьте 0,87 микролитра специального праймера для анализа и добавьте 1,83 микролитра воды, не содержащей нуклеаз. Аккуратно перемешайте комбинацию и переложите по 11,4 микролитра в каждую пробирку, содержащую кДНК, и в контрольную группу без шаблона. Затем аккуратно перемешайте пробирки и соберите содержимое пробирки с помощью импульсного центрифугирования. Для достижения оптимальных результатов загрузите чипы как можно скорее.

Подключите загрузчик стружки и подождите, пока индикатор не загорится зеленым цветом. Затем приготовьте шприц с погружной жидкостью, осторожно потянув поршень на 1-2 миллиметра, затем снимите колпачок и добавьте наконечник.

Затем обратите внимание на код, написанный на крышке нового чипа, затем осторожно держите крышку сбоку, снимите защитную пленку и поместите ее в гнездо крышки липкой стороной вверх. Теперь нажмите на рычаг, чтобы открыть зажим, и осторожно загрузите щепу в гнездо для стружки.

Далее вставьте в погрузчик новое погрузочное лезвие. Осторожно надавите на него, чтобы убедиться, что он надежно закреплен на месте. Теперь перенесите 14,5 микролитров реакционной смеси на загрузочное лезвие. Не допускайте образования пузырьков воздуха, и не отклоняйте лезвие. Затем нажмите черную кнопку «Loading», чтобы распределить объем на чип.

Важно убедиться, что загрузочное лезвие находится на месте. Затем, заполняя лезвие, не нажимайте на пипетку до второго упора, чтобы избежать появления пузырьков. Также не отклоняйте лезвие кончиком.

Затем с помощью шприца нанесите около 20 капель погружной жидкости на поверхность чипа. Следите за тем, чтобы не касаться поверхности кончиком, и полностью покрывайте поверхность, не переливая ее. Затем поверните рычаг ротора, чтобы крышка соприкоснулась с чипом, и нажмите на него в течение 15 секунд. Затем нажмите кнопку крышки, чтобы освободить стружку и вернуть рычаг погрузчика в исходное положение. Теперь откройте зажим и держите собранный чип под углом 45 градусов, чтобы осторожно распределить погружную жидкость через заливное отверстие с помощью шприца. Затем слегка поверните чип, чтобы удалить пузырьки воздуха, а затем удалите лишнюю жидкость стерильной салфеткой.

Избегайте проливания погружной жидкости на границу наконечника. В этом случае осторожно удалите излишки перед запечатыванием.

Наконец, закройте корпус чипса, аккуратно сняв этикетку с крышки, а затем заблокируйте заливное отверстие не менее чем на 5 секунд. Теперь используйте чип в течение двух часов, а до тех пор храните его в темноте.

Чтобы настроить реакцию, откройте крышку и установите адаптеры на оба блока, даже если используется один блок. Затем поместите чип на образцы блоков и сориентируйте его заполняющие отверстия к передней части термоамплификатора и немного приподнимите порт. Используйте пустые фишки, чтобы сбалансировать два блока.

Далее положите термопрокладку на установку, чтобы полностью покрыть стружку. Затем запрограммируйте циклы, закройте крышку и начните реакцию.

Когда реакция закончится, выключите термоамплификатор, снимите термопрокладки, а затем удалите стружку. Дайте чипсам оттаять до комнатной температуры не менее 10 минут в темноте и проанализируйте их в течение часа. Очистите поверхность чипа изопропанолом во время осмотра на наличие утечек или других проблем.

Чтобы сохранить данные, вставьте USB-накопитель в систему детектора, на котором можно сохранить данные. Затем откройте лоток для чипа детекторной системы и загрузите чип лицевой стороной вверх. Закройте лоток и подождите 30 секунд, пока данные будут обработаны. Затем удалите чип и повторите процесс для следующего чипа.

Далее переместите флешку с датчика на компьютер, и перенесите файлы. Откройте облачное программное обеспечение, затем создайте проект и импортируйте все файлы данных для интересующих чипов. Затем на вкладке «Определенные чипы» выберите используемый краситель и анализ. Определите, является ли чип приемлемым, визуализировав его во вкладке «Обзор данных». Если образец был загружен хорошо, по крайней мере 13 000 точек должны быть пригодны для использования.

Далее посмотрите на диаграмму рассеяния для выбранной фишки. Там примените пороговое значение, определяемое типом анализа. Для сигнала флуоресцеина аминитного репортерного красителя используйте порог 6000. Теперь удалите все сомнительные сигналы, которые могут привести к ложным срабатываниям. Выделите сомнительное место на диаграмме рассеяния с помощью инструмента «Лассо» и выберите опцию «Неопределенный».

Все остальные положительные пятна указывают на наличие копий кДНК анализируемой редкой мишени.