Геном широкий наблюдения ошибок транскрипции в эукариотических организмов

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области транскрипционного мутагенеза, например, какие субъединицы РНК-полимеразы или биологические процессы контролируют точность транскрипции. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет измерять эндогенные ошибки транскрипции в транскриптомах эукариотических организмов. Как правило, люди, плохо знакомые с этим протоколом, будут испытывать трудности из-за длины и сложности анализа, а также потребности в продвинутой биоинформатике для интерпретации данных.

Чтобы начать протокол, циркуляризируйте фрагменты РНК путем термической денатурации 20 микролитров ранее подготовленного образца при температуре 65 градусов Цельсия в течение одной минуты. Через одну минуту сразу же поместите образец на лед на две минуты. Затем добавьте четыре микролитра 10-кратного буфера РНК-лигазы Т4, четыре микролитра 10 миллимоляр АТФ, один микролитр ингибитора РНКазы, один микролитр воды, свободной от нуклеазы, и восемь микролитров 50% полиэтиленгликоля или ПЭГ.

Затем тщательно перемешайте образец с помощью вортекса. Затем добавьте два микролитра по 10 единиц на микролитр Т4 РНК-лигазы один. Снова перемешайте образец с помощью пипетирования и инкубируйте его при температуре 25 градусов Цельсия в течение двух часов в амплификаторе с температурой крышки 30 градусов Цельсия.

После двухчасовой инкубации добавьте в образец 10 микролитров воды, не содержащей нуклеаз, и очистите образец с помощью набора для очистки и концентрации олиго. Разбавьте образец в 20 микролитрах воды, свободной от нуклеазы. Чтобы провести обратную транскрипцию кольцевых молекул РНК, добавьте четыре микролитра 10 миллимоляров dNTP, четыре микролитра 50 нанограмм на микролитр случайных гексамеров и девять микролитров свободной нуклеазы воды к девяти микролитрам РНК.

Тщательно перемешайте с помощью пипетирования и денатурируйте образец при температуре 65 градусов Цельсия в течение одной минуты. После денатурации образца поместите его на лед на две минуты. Добавьте в образец восемь микролитров 5-кратного буфера для синтеза первой цепи, два микролитра 0,1 миллимоляра DTT и четыре микролитра 200 единиц обратной транскриптазы 200 единиц на микролитр и перемешайте пипеткой.

Инкубируйте образец при температуре 25 градусов Цельсия в течение 10 минут с крышкой, установленной на пять градусов Цельсия выше температуры инкубации. Затем инкубируйте образец в течение 20 минут при температуре 42 градуса Цельсия при температуре крышки 47 градусов Цельсия. Разбавьте образец в 42 микролитрах элюирующего раствора после очистки с помощью набора для очистки и концентратора.

Используйте набор для синтеза второй цепи для создания двухцепочечной библиотеки кДНК. Поместите образцы на лед и добавьте 30 микролитров воды NF к 38 микролитрам образца. Затем добавьте восемь микролитров 10-кратного двухцепочечного буфера и четыре микролитра второцепочечного фермента и перемешайте образец с помощью осторожного пипетирования перед инкубацией при 16 градусах Цельсия в течение двух с половиной часов.

Очистите образцы с помощью набора для очистки и концентрации олиго для реакций объемом 100 микролитров и разбавьте образцы 38 микролитрами воды, не содержащей нуклеаз. Смешайте концевую реакцию с помощью пипетирования и инкубируйте при температуре 20 градусов Цельсия в течение 30 минут. После инкубации при температуре 20 градусов Цельсия следует 30-минутная инкубация при температуре 65 градусов Цельсия.

Во-первых, разбавьте адаптеры для секвенирования нового поколения в десять раз в 10 мМоляр трис HCl до конечной концентрации 1,5 мкМоляр. Затем добавьте в каждый образец 2,5 микролитра разведенного адаптера и по одному микролитру усилителя лигирования и перемешайте их путем вортексирования. Далее добавьте 15 микролитров тупой мастер-смеси ТА лигазы.

Перемешайте образец пипеткой вверх и вниз, и инкубируйте его при температуре 20 градусов Цельсия в течение 15 минут. Затем добавьте три микролитра фермента специфического эксцизионного реагента урацила и инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. После завершения лигирования добавьте в образец 13,5 микролитров воды, не содержащей нуклеазы, в общем объеме 100 микролитров и приступайте к выбору размера.

Акклиматизируйте магнитные бусины до комнатной температуры. Добавьте 30 микролитров акклиматизированных, ресуспендированных магнитных шариков в каждый образец и перемешайте с помощью пипетирования. Переложите образец в пробирку объемом 1,5 миллилитра и инкубируйте его при комнатной температуре в течение пяти минут.

Поместите образец на магнитную подставку на пять минут, чтобы отделить бусины от надосадочной жидкости. Переложите надосадочную жидкость в новую 1,5-миллилитровую трубку и утилизируйте магнитные шарики. Добавьте в каждый образец свежую аликвоту из 15 микролитров магнитных шариков.

Тщательно перемешайте с помощью пипетки и выдержите в течение пяти минут при комнатной температуре. Поместите образцы на магнитный штатив и инкубируйте их в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем аккуратно удалите и утилизируйте надосадочную жидкость, следя за тем, чтобы не потревожить бусины.

Добавьте 200 микролитров 80% свежеприготовленного этанола в каждый из образцов, не нарушая гранулированные магнитные шарики, и инкубируйте в течение 30 секунд. Затем полностью удалите все следы этанола с образцов и высушите бусины на воздухе в течение пяти минут, но будьте осторожны, чтобы не пересушить бусины. Чтобы вымыть образцы из бусин, извлеките трубки из магнитной стойки.

Добавьте 19 микролитров 10 миллимолар tris HCl. Пипеткой перемешайте смесь вверх и вниз несколько раз, чтобы повторно суспендировать шарики, и инкубируйте образцы в течение пяти минут при комнатной температуре. Поместите образцы обратно на магнитную подставку и инкубируйте их в течение пяти минут, чтобы отделить гранулы от надосадочной жидкости.

Осторожно удалите из пробирок 15 микролитров надосадочной жидкости, содержащей очищенные, подобранные по размеру библиотеки кДНК, и переложите их в свежую пробирку объемом 1,5 миллилитра. Добавьте пять микролитров универсального праймера и пять микролитров уникального индексного праймера в каждую очищенную библиотеку кДНК и тщательно перемешайте их с помощью пипетирования. Внимательно проверьте мастер-смесь полимеразы на наличие кристаллов и других осадков и прогрейте мастер-смесь вручную до тех пор, пока осадки не растворятся.

Добавьте в образец 25 микролитров мастер-смеси полимеразы. Смешайте образец с помощью пипетирования и следуйте условиям циклирования, перечисленным в сопроводительном текстовом протоколе для амплификации ПЦР. Очистите итоговые библиотеки, добавив 45 микролитров ресуспендированных магнитных шариков непосредственно в реакцию ПЦР.

Смешайте их с помощью пипетки и выдержите при комнатной температуре в течение пяти минут. Переложите образец в пробирку объемом 1,5 миллилитра и поместите ее в магнитную подставку на пять минут. После инкубации выбросьте надосадочную жидкость и дважды промойте ее свежеприготовленным 80%-ным этанолом в течение 30 секунд.

После второй промывки полностью удалите этанол из образца и высушите гранулу гранул на воздухе в течение пяти минут. Затем разбавьте его в 35 микролитрах 0,1x TE. Повторно суспензируйте бусины, пипетируя их, и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. После того как тюбик простоит на магнитной подставке пять минут, переложите 30 микролитров надосадочной жидкости в свежую 1,5-миллилитровую трубку.

Храните библиотеки при температуре минус 80 градусов по Цельсию. После выделения РНК на электрофоретограмме видны два отчетливых пика рРНК. Фрагментация РНК приводит к образованию от 50 до 70 фрагментов РНК пар оснований.

Обратная транскрипция с вращающимся кругом была использована для получения молекул кДНК, которые состоят по меньшей мере из трех тандемных повторов матриц кольцевой РНК. Выбор размера с помощью магнитных бусин позволяет очищать библиотеки соответствующего размера. Информация о секвенировании одной библиотеки C-seq показывает, что большинство повторов имеют длину от 45 до 80 оснований.

Примерно 50% оснований, которые были секвенированы, являются частью этих повторов. Поскольку большинство этих оснований присутствует в скоростях, содержащих три или более повторов, количество секвенированных уникальных оснований составляет примерно одну треть от общего числа секвенированных оснований. После того, как она будет освоена, эту технику можно будет выполнить за два-три дня, если она будет выполнена правильно.

При выполнении этой процедуры важно всегда поддерживать стерильную рабочую среду, свободную от РНК, которые могут помешать вашей работе. Также важно внимательно следить за каждым шагом, чтобы не допустить ошибок во время процедуры. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерить ошибки транскрипции у эукариот с помощью анализа C-seq.