Подготовка, развитие периферийных обонятельных ткани для молекулярной и Иммуногистохимический анализ у дрозофилы

Здесь мы представляем протокол к сцене и проанализируем развитие обоняния ткани от дрозофилы видов. Иссеченную ткань могут затем использоваться для молекулярного анализа, например количественного RT-PCR (обратный транскрипции-полимеразной цепной реакции) или РНК последовательности (RNAseq), а также в естественных условиях анализ таких иммуногистохимия или на месте гибридизации.

Общей целью определения стадии и препарирования развивающихся тканей зрачка и периферии взрослого пола у видов дрозофил является получение образцов для молекулярного анализа и анализа развития периферических обонятельных тканей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития и эволюции обонятельных систем, такие как экспрессия, динамика, уровни и паттерны конкретных генов в развивающихся периферических обонятельных тканях. С помощью этого метода мы можем получить представление о развивающейся периферической обонятельной системе у видов дрозофил.

Он также может быть применен к другим сенсорным системам, таким как периферическая система вкуса и зрительная система. Для эксперимента по секвенированию РНК запланируйте сбор от 100 до 200 антенных дисков или антенн для четырех различных стадий развития. Для иммуногистохимии запланируйте препарирование от 10 до 20 мух.

Очистите все материалы, участвующие в вскрытии, используя 70% этанол. Затем дополнительно очистите материалы нейтрализаторами РНКазы. И все растворы делать с использованием воды, не содержащей нуклеазы или обработанной DEPC.

Чтобы собрать куколок, следите за личинками с интервалом в 30 минут. И собрать куколку в нулевой час стадии предкуколки APF. Личинки будут неподвижны и окружены очень светлой, почти белого цвета куколкой.

На этом этапе переложите личинок в маленькую двухдюймовую чашку Петри с влажной фильтровальной бумагой. Для проведения этапа APF в нулевой час приступают к забору предзрачного диска усиков. В противном случае накройте посуду парафиновой пленкой и дайте животным развиваться при температуре 25 градусов Цельсия, пока они не окажутся на интересующей стадии развития.

Чтобы инсценировать развитие куколок других видов дрозофил, соберите личинки нулевого часа и отсортируйте их в свежий флакон. Затем запишите количество дней от предкуколки до взрослого возраста. И просто масштабируйте это время до временной шкалы для меланогастера.

Для начала охладите 150 микролитров раствора для выделения РНК в 1,5-миллиметровой пробирке без РНКазы. Затем нанесите несколько отдельных капель PBS на диск для вскрытия. В каждую каплю PBS поместите по одной куколке, которую нужно препарировать.

Для куколок от нуля до двух часов используйте щипцы, чтобы захватить крючки для рта и потянуть за эти структуры, чтобы вырвать и обнажить мозг и имагинальные диски. В течение восьмичасового периода куколки сначала осторожно отделите куколку от самой передней четверти куколки, чтобы обнажить развивающуюся головку. Затем отделите голову в месте шейного сустава.

Усиковые диски находятся в голове на этой стадии развития. Теперь перенесите ткани, содержащие диски усиков, в другую каплю PBS. Далее определите диск усиков глаза, соединенный с мозгом в зрительных долях.

С помощью щипцов отсоедините диск глазного усика и перенесите его на новую каплю. У восьмичасовых куколок глазные диски обхватывают антенные диски, и оба они находятся перед мозгом. Следующей каплей разделите глаз и диски усиков с помощью щипцов.

Затем с помощью наконечника пипетки P20 аккуратно соберите рассеченную ткань с минимальным количеством жидкости. Поместите диск в реагент для изолирующего раствора РНК и продолжайте рассекать диски антенн до тех пор, пока не будет собрано не менее 100 дисков. Через 40 часов после образования куколки взрослая антенна принимает свою окончательную форму, но все еще остается прозрачной.

На этом этапе для сбора последовательностей РНК необходимо не менее 50 прекуколок. Сначала приготовьте 150 микролитров охлажденного раствора для выделения РНК. На подушечке для вскрытия поместите куколку в каплю PBS.

Затем стабилизируйте тело с помощью одной пары щипцов и аккуратно отклейте куколку от самой передней четверти, чтобы обнажить головку. Затем аккуратно удалите головку в месте шейного сустава. Теперь аккуратно переложите головку в чистую каплю PBS.

Там, чтобы удалить мембрану, окружающую головку, пипетируйте головку вверх и вниз в PBS. При такой очистке антенна должна стать видимой. Теперь отсоедините антенну от мембраны между вторым и третьим сегментами в месте сегментарного соединения.

Третий сегмент содержит обонятельные рецепторы усиков. Затем с помощью пипетки аккуратно перенесите рассеченную ткань в раствор для выделения РНК, минимизируя количество переносимой жидкости. Для извлечения РНК препарируйте взрослых особей, пока они находятся под наркозом на салфетке с CO2.

Во-первых, обработайте прокладку CO2 и щипцы ингибиторами РНКазы. Затем сделайте взрослым обезболивание и осмотрите подушечку под микроскопом для вскрытия. С помощью двух пар щипцов стабилизируйте тело и аккуратно вытяните или отщипните третий сегмент усиков от второго сегмента антенны для сбора тканей.

Перенесите антенны в пробирку с раствором для изоляции РНК, опустив щипцы в жидкость и отпустив их. Антенна должна быть погружена в воду. Если антенна прилипнет к боковой стенке, РНК будет преждевременно деградировать.

Собрав достаточное количество усиков, приступайте к выделению РНК. Или храните пробирку для сбора при температуре 80 градусов Цельсия на неопределенный срок. Если антенны предназначены для иммуногистохимии, выполняйте это вскрытие на дискотеке, погружая муху в PBS с тритоном или без него.

Рассеченная развивающаяся обонятельная ткань может быть использована для экстракции РНК с последующей ОТ-ПЦР для оценки экспрессии генов. Например, таким образом можно изучать экспрессию транскриптов поверхностных рецепторов и транскриптов обонятельных рецепторов. В качестве альтернативы, ткани могут быть использованы для иммуногистохимии для определения характера экспрессии и субклеточной локализации генов, представляющих интерес.

Например, трансгенные мухи Rn-EGFP могут быть окрашены антителами против GFP и против ламинина. Анализ показывает, что через 40 часов после образования куколки ген Or67d активен в определенных клетках антенны, управляя экспрессией GFP в системе GAL4-UAS. После освоения вскрытия можно проводить за один час, если они выполнены правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о соблюдении времени и соответствующем графике сбора, старения и препарирования, основанных на временных рамках развития куколки для каждого вида дрозофилы. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как qRT-ПЦР, иммуногистохимия, а также другие методы окрашивания in vivo и транскрипционного профилирования, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся характера и профилей транскрипции на системном уровне в развивающейся ткани. После его разработки этот метод проложит путь для исследователей в области эволюции и развития сенсорных систем для изучения транскрипционной динамики и открытия новых генов в других сенсорных системах у видов дрозофил.

Не забывайте, что работа с острыми щипцами, некоторыми растворами для экстракции РНК и формальдегидом может быть крайне опасной. При выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как предыдущая практика с рассечением, развитие мелкой моторики, высокая внимательность и ношение соответствующей лабораторной одежды.