Модель In Vitro Batch-culture для оценки влияния интервенционных режимов на человеческую фекальную микробиоту
31 июля 2019 г.
Этот протокол описывает систему брожения в партии в пробирке фекальной микробиоты человека, используя инулин (известный пребиотик и один из наиболее широко изученных модуляторов микробиоты), чтобы продемонстрировать использование этой системы в оценке эффектов конкретных вмешательства по составу фекальной микробиоты и метаболической деятельности.
Учитывая возникающие роли микрофлоры кишечника в различных заболеваний человека, несколько микрофлоры кишечника модуляторы, как пробиотики, пребиотики, диеты и лекарства могут помочь в улучшении кишечника микробиом связанных заболеваний здоровья. Однако нет быстрой и доступной системы скрининга доступны для прогнозирования последствий таких микрофлоры кишечника модуляторов, но эта система достаточно проста, чтобы предсказать, как конкретные мероприятия могут повлиять на микрофлору кишечника, что в конечном итоге может повлиять на здоровье хозяина. Этот протокол прост, доступен и практичн для лабораторий, исследуя модуляторы микробиома кишечника и их влияние на микробиоту и здоровье хозяина.
Поддержание асептических и анаэробных условий имеет решающее значение для этого эксперимента. Также фекальный образец следует использовать заново, сразу после сбора. В противном случае, если эксперимент запланирован позже, образец должен храниться при температуре минус 80 сразу после сбора, без какого-либо воздействия температуры окружающей среды и воздуха.
Точность обработки во время подготовки aliquot и пипетки также имеет важное значение для поддержания точности и воспроизводимости. В дневное время это займет менее 12 часов. Мы можем построить культуру в одночасье, если они нуждаются в образцах в течение 24 часов.
Затем следуют короткокого цепи жирных кислот и определение микробиома. Этот процесс будут продемонстрированы двумя великими студентами уни, Shokouh Ахмади и Рабина Mainali из моей лаборатории. Для приготовления ферментационных средств под дымовой капотом, в реагентной бутылке на магнитной смеси, смешивают раствор А, раствор В, микроэлементный раствор, водорастворимый витаминный раствор, раствор фолиевой кислоты биотин, раствор рибофлавина, раствор гемина, короткоко цепную смесь жирных кислот и ресазурин.
Затем добавить в бутылку дрожжевой экстракт, карбонат натрия, гидрохлорид цистеин моногидрат, и trypticase. Добавьте 296,1 миллилитров дистиллированной воды, отрегулируйте рН с помощью одного нормального гидрохлорида или гидроксида натрия, чтобы убедиться, что он составляет около 7,0. Перенесите стакан на асептическую рабочую станцию и используйте вакуумный фильтр размером поры размером 0,22 микрометра для фильтрации мультимедиа для стерилизации.
Для приготовления одного литрового анаэробного раствора разбавления растворяют пять граммов хлорида натрия, два грамма глюкозы и 0,3 грамма моногидрата гидрохлорида цистеида в ионизированной воде. Автоклав реагент бутылку с крышкой при 121,1 градусов по Цельсию в течение 15 минут, и хранить его в анаэробной камере. Перед началом эксперимента брожения, держать все материалы, растворы и инструменты, необходимые для брожения эксперимента внутри анаэробной камеры, по крайней мере 48 часов, чтобы убедиться, что любой остаток кислорода удаляется.
По крайней мере за 24 часа до эксперимента брожения, весят 300 миллиграммов инулина, и передать его в 50 миллилитров трубки, которая затем помещается в анаэробной камере. Добавить 26 миллилитров стерилизованных средств брожения в трубку, и вихрь, чтобы смешать. Разрешить увлажнение клетчатки в течение примерно 24 часов.
В день ферментационного эксперимента приготовьте фекальный инокулум. Во-первых, вес пять граммов свежего фекального образца в 50 миллилитров конической трубки. Добавьте анаэробный раствор разбавления в трубку, чтобы достичь конечного объема в 50 миллилитров.
Вихрь в течение 15 минут, или пока полностью гомогенизированы. Держите привитые трубки при 37 градусах Цельсия внутри анаэробной камеры и аккуратно инвертировать один раз в час, чтобы повторно использовать волокна и инокулы. После трех, шести, девяти или 24 часов, вынуть надлежащее количество ферментированных средств массовой информации, и центрифуга образцов на 14000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию.
Немедленно заморозить супернатант и гранулы в жидком азоте, затем после замораживания оснастки, хранить супернатант для анализа короткой цепи жирных кислот, и гранулы для анализа микробиома, при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Этот протокол используется для демонстрации эффекта конкретного пребиотика. Фекалии здоровых людей, после лечения инулином, показали относительно стабильный рН в течение девяти часов, в то время как резко упал после 24 часов.
Прививка инулина значительно увеличила уровень короткокоголовых жирных кислот и лактата в инулин-обработанном фекальное образца по сравнению с необработанной фекальной микробиотой культуры. Основной анализ координат показывает различный состав микробиоты по взвешенным и невзвешенным мерам UniFrac по бета-разнообразию между обработанными инулином и необработанными образцами. Индексы альфа-разнообразия по сравнению с филогенетическим разнообразием через PD целое дерево, богатство видов, эксплуатационные таксономические единицы, равномерность видов, а также относительное изобилие основных фила и родов, все присутствующие различные подписи микрофлоры кишечника между инулин обработанных и необработанных образцов.
Таксономическая кладограмма, полученная на основе линейного анализа размера эффекта дискриминанта 16S последовательностей, представляет собой дифференцированно обильный таксон между различными группами образцов. Внимательно следуйте всем шагам. Самое главное – поддерживать строгие асептические и анаэробные условия.
Супернатант и из эксперимента могут быть использованы для лечения коротковолокновых жирных кислот изменения уровня в результате брожения на основе волокон. Кроме того, гранулы могут быть использованы для анализа изменений в составе микрофлоры кишечника. Некоторые химические вещества, используемые для создания культурных средств массовой информации являются потенциально опасными.
Пожалуйста, лист MSDS и принять соответствующие меры предосторожности.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается система периодического культивирования микробиоты кишечника человека in vitro с использованием инулина для оценки влияния специфических воздействий на состав микробиоты и ее метаболическую активность.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Исследования микробиома
- Здоровье кишечника
- Пребиотический эффект
Теоретические основы
- Микробиом кишечника играет важнейшую роль в поддержании здоровья человека.
- Модуляторы, такие как пребиотики, могут оказывать влияние на микробиоту кишечника.
- Современные системы скрининга эффектов микробиома кишечника ограничены.
- Данный протокол предлагает практическое решение для лабораторных исследований.
Цель исследования
- Разработать простую и доступную систему скрининга.
- Предсказать влияние вмешательств на микробиоту кишечника.
- Углубить понимание роли микробиоты в поддержании здоровья организма хозяина.
Используемые методы
- Система ферментации в периодическом режиме in vitro.
- Использование свежих образцов фекалий или их надлежащее хранение при -80°C.
- Поддержание асептических и анаэробных условий.
- Оценка состава микробиоты и метаболической активности.
Основные результаты
- Система эффективно предсказывает эффекты специфических воздействий.
- Продемонстрированы изменения в составе микробиоты кала.
- Выявлены метаболические активности, на которые влияет инулин.
- Получены данные о модуляции микробиома кишечника.
Выводы
- Данный протокол является ценным инструментом для исследования микробиома.
- Он позволяет оценивать эффективность вмешательств, направленных на оздоровление кишечника.
- Способствует проведению дальнейших исследований микробиоты и здоровья хозяина.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Высокопроизводительные модели пакетного культивирования in vitro для микробиоты кишечника человека позволяют проводить быстрый и масштабируемый скрининг модуляторов микробиома без использования исследований на животных или людях. Этот подход способствует снижению рисков на ранних этапах разработки кандидатных препаратов, предоставляя количественные, воспроизводимые данные о составе микробиоты и метаболических продуктах. Интеграция таких моделей в процессы поиска и разработки ускоряет оценку пребиотиков, пробиотиков и пищевых соединений для портфелей средств по поддержанию здоровья кишечника.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить функциональный анализ модуляторов микробиома на микробных сообществах человеческого происхождения.
- Способствует снижению биологических рисков путем количественной оценки сдвигов в разнообразии микробиоты и метаболической активности.
- Повышает прогностическую уверенность при выборе перспективных методов вмешательства для дальнейшей разработки.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированную, воспроизводимую систему для оценки влияния вмешательств на состав микробиоты.
- Позволяет получать количественные данные, такие как уровни pH, лактата и короткоцепочечных жирных кислот, для сравнительного анализа.
- Поддерживает масштабируемый скрининг нескольких соединений или режимов в параллельных рабочих процессах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты in vitro с сигнатурами микробиома, имеющими отношение к заболеванию, для обеспечения трансляционной непрерывности.
- Позволяет осуществлять продвижение кандидатов с учетом рисков на основе механистических и метаболических показателей.
- Поддерживает поиск биомаркеров путем установления связи между изменениями, вызванными вмешательством, и измеряемыми результатами.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная модель культивирования в режиме периодического процесса in vitro применяется на этапе между первичным поиском и идентификацией ведущих соединений, предоставляя практически значимые данные перед началом доклинических исследований in vivo.
- Открытия в биологии: обеспечивает проверку гипотез о модуляции микробиома и влиянии на метаболические пути.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные результаты для сравнения различных вмешательств.
- Аналитика: позволяет проводить статистический анализ состава микробиоты и метаболических сдвигов.
- Трансляционные исследования: связывает результаты in vitro с доклинической валидацией при наличии данных о метаболизме и разнообразии.
- Корпоративное повторное использование: предоставляет многократно используемую платформу для постоянной оценки различных кандидатов, воздействующих на микробиом.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при поиске мишеней в микробиоме.
- Операционная ценность: стандартизирует рабочие процессы и повышает воспроизводимость в рамках кампаний по скринингу.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и распределение капитала за счет предоставления ранних практически значимых данных.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию модуляторов микробиома для дальнейшего продвижения с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области анаэробной микробиологии и владение методами асептической техники.
- Необходим доступ к анаэробным камерам и аналитическим платформам для профилирования метаболитов и микробиома.
- Требуется строгая стандартизация между исследовательскими группами в вопросах обработки образцов и анализа данных.
- Может потребоваться адаптация метода для различных источников донорского материала или типов вмешательств.
- Потенциальная опасность химических реагентов требует строгого соблюдения протоколов безопасности.
