Модель In Vitro Batch-culture для оценки влияния интервенционных режимов на человеческую фекальную микробиоту

Учитывая возникающие роли микрофлоры кишечника в различных заболеваний человека, несколько микрофлоры кишечника модуляторы, как пробиотики, пребиотики, диеты и лекарства могут помочь в улучшении кишечника микробиом связанных заболеваний здоровья. Однако нет быстрой и доступной системы скрининга доступны для прогнозирования последствий таких микрофлоры кишечника модуляторов, но эта система достаточно проста, чтобы предсказать, как конкретные мероприятия могут повлиять на микрофлору кишечника, что в конечном итоге может повлиять на здоровье хозяина. Этот протокол прост, доступен и практичн для лабораторий, исследуя модуляторы микробиома кишечника и их влияние на микробиоту и здоровье хозяина.

Поддержание асептических и анаэробных условий имеет решающее значение для этого эксперимента. Также фекальный образец следует использовать заново, сразу после сбора. В противном случае, если эксперимент запланирован позже, образец должен храниться при температуре минус 80 сразу после сбора, без какого-либо воздействия температуры окружающей среды и воздуха.

Точность обработки во время подготовки aliquot и пипетки также имеет важное значение для поддержания точности и воспроизводимости. В дневное время это займет менее 12 часов. Мы можем построить культуру в одночасье, если они нуждаются в образцах в течение 24 часов.

Затем следуют короткокого цепи жирных кислот и определение микробиома. Этот процесс будут продемонстрированы двумя великими студентами уни, Shokouh Ахмади и Рабина Mainali из моей лаборатории. Для приготовления ферментационных средств под дымовой капотом, в реагентной бутылке на магнитной смеси, смешивают раствор А, раствор В, микроэлементный раствор, водорастворимый витаминный раствор, раствор фолиевой кислоты биотин, раствор рибофлавина, раствор гемина, короткоко цепную смесь жирных кислот и ресазурин.

Затем добавить в бутылку дрожжевой экстракт, карбонат натрия, гидрохлорид цистеин моногидрат, и trypticase. Добавьте 296,1 миллилитров дистиллированной воды, отрегулируйте рН с помощью одного нормального гидрохлорида или гидроксида натрия, чтобы убедиться, что он составляет около 7,0. Перенесите стакан на асептическую рабочую станцию и используйте вакуумный фильтр размером поры размером 0,22 микрометра для фильтрации мультимедиа для стерилизации.

Для приготовления одного литрового анаэробного раствора разбавления растворяют пять граммов хлорида натрия, два грамма глюкозы и 0,3 грамма моногидрата гидрохлорида цистеида в ионизированной воде. Автоклав реагент бутылку с крышкой при 121,1 градусов по Цельсию в течение 15 минут, и хранить его в анаэробной камере. Перед началом эксперимента брожения, держать все материалы, растворы и инструменты, необходимые для брожения эксперимента внутри анаэробной камеры, по крайней мере 48 часов, чтобы убедиться, что любой остаток кислорода удаляется.

По крайней мере за 24 часа до эксперимента брожения, весят 300 миллиграммов инулина, и передать его в 50 миллилитров трубки, которая затем помещается в анаэробной камере. Добавить 26 миллилитров стерилизованных средств брожения в трубку, и вихрь, чтобы смешать. Разрешить увлажнение клетчатки в течение примерно 24 часов.

В день ферментационного эксперимента приготовьте фекальный инокулум. Во-первых, вес пять граммов свежего фекального образца в 50 миллилитров конической трубки. Добавьте анаэробный раствор разбавления в трубку, чтобы достичь конечного объема в 50 миллилитров.

Вихрь в течение 15 минут, или пока полностью гомогенизированы. Держите привитые трубки при 37 градусах Цельсия внутри анаэробной камеры и аккуратно инвертировать один раз в час, чтобы повторно использовать волокна и инокулы. После трех, шести, девяти или 24 часов, вынуть надлежащее количество ферментированных средств массовой информации, и центрифуга образцов на 14000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию.

Немедленно заморозить супернатант и гранулы в жидком азоте, затем после замораживания оснастки, хранить супернатант для анализа короткой цепи жирных кислот, и гранулы для анализа микробиома, при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Этот протокол используется для демонстрации эффекта конкретного пребиотика. Фекалии здоровых людей, после лечения инулином, показали относительно стабильный рН в течение девяти часов, в то время как резко упал после 24 часов.

Прививка инулина значительно увеличила уровень короткокоголовых жирных кислот и лактата в инулин-обработанном фекальное образца по сравнению с необработанной фекальной микробиотой культуры. Основной анализ координат показывает различный состав микробиоты по взвешенным и невзвешенным мерам UniFrac по бета-разнообразию между обработанными инулином и необработанными образцами. Индексы альфа-разнообразия по сравнению с филогенетическим разнообразием через PD целое дерево, богатство видов, эксплуатационные таксономические единицы, равномерность видов, а также относительное изобилие основных фила и родов, все присутствующие различные подписи микрофлоры кишечника между инулин обработанных и необработанных образцов.

Таксономическая кладограмма, полученная на основе линейного анализа размера эффекта дискриминанта 16S последовательностей, представляет собой дифференцированно обильный таксон между различными группами образцов. Внимательно следуйте всем шагам. Самое главное – поддерживать строгие асептические и анаэробные условия.

Супернатант и из эксперимента могут быть использованы для лечения коротковолокновых жирных кислот изменения уровня в результате брожения на основе волокон. Кроме того, гранулы могут быть использованы для анализа изменений в составе микрофлоры кишечника. Некоторые химические вещества, используемые для создания культурных средств массовой информации являются потенциально опасными.

Пожалуйста, лист MSDS и принять соответствующие меры предосторожности.