Люминесценция Пожизненное изображение O₂ с частотой домена на основе камеры системы

Мы описываем использование новой, частотно-домен люминесценции жизни камеры для отображения 2D O₂ распределения с оптическим датчиком фольги. Описаны камеры системы и процедуры анализа изображений наряду с подготовкой, калибровкой и применением сенсорной фольги для визуализации микросреды O₂ в rhizosphere водных растений.

Как лучший электронный прием, кислород играет решающую роль в биологических системах. С помощью этого протокола вы можете изображение распределения кислорода в 2D с помощью оптода. В дополнение к высокому пространственному и временному разрешению, этот метод не требует дополнительного эталонного красителя, является чрезвычайно надежным и позволяет получить структурное изображение.

Этот метод может быть применен к различным областям исследований, в которых кислород играет ключевую роль, включая экологию, медицинские исследования, биопечать и чувствительные к давлению печати. Изготовление оптода может быть сложной задачей, так как количество коктейля, добавленного в опорную фольгу и скорость перетаскивания ножного покрытия, может потребовать оптимизации и практики. С помощью этого видео вклад, мы хотим сделать этот мощный метод доступным для исследователей из других областей исследования.

Чтобы подготовить планарный кислородный оптод, сначала используйте пленку воды или 70% этанола, чтобы зафиксировать чистую без пыли ПЭТ-фольгу на чистой стеклянной пластине. Поместите чистый 120-метровый нож покрытие устройства на фольгу и использовать стеклянную пипету для нанесения линии сенсорного коктейля перед устройством. Далее, перетащите нож покрытие устройства медленно и равномерно над ПЭТ фольги для равномерного распространения коктейля.

Затем высушите готовый планарный кислород чувствительный оптод в окружающем воздухе в течение одного часа перед сушкой на ночь в нагретом шкафу при температуре от 50 до 60 градусов по Цельсию. К следующему утру будет получен слой толщиной около 12 микрометров. Храните оптод, защищенный от света, до дальнейшего использования.

Для подготовки rhizo-сэндвич камеры, использовать свет излечимый акрил на основе мгновенного клея клей микроскоп слайды по краям стеклянной пластины оставляя один длинный край открытым. Вырезать планар optode в требуемой форме и размере, чтобы вписаться в пространство между клееным микроскопом слайды и место оптоды на внутренней стороне передней стеклянной пластины с покрытием стороны вверх. Лента один край оптоды фольги на стеклянную тарелку и добавить водопроводную воду между стеклянной пластины и оптоды фольги.

Медленно опустите фольгу на капли воды, позволяя оптоду выпрямиться на поверхности стекла и использовать мягкую ткань, чтобы тщательно удалить пузырьки воздуха, захваченные между оптодом и пластиной. Затем протрите стеклянную пластину сухой и ленты оставшиеся края фольги на тарелку. Далее используйте плоскую стеклянную пластину, чтобы равномерно распределить 0,5 миллиметра сито по всей пластине до той же толщины, что и микроскоп слайд-промечений.

Тщательно очистите верхнюю поверхность слайда микроскопа, чтобы убедиться, что вторая стеклянная пластина уплотняет камеру должным образом и нанесите силиконовую смазку на поверхность слайда микроскопа. Затем накройте осадок тонкой пленкой воды, тщательно избегая образования пузырьков воздуха. Перед тем, как поместить образец на осадок, тщательно промойте один выстрел из Littorella uniflora и располагайте стрелять по отложениям с листьями, торчащими из верхней открытой стороны.

Когда образец на месте, поместите стеклянную пластину с оптодом на осадок и применить мягкое давление, чтобы привести оптоду в тесном контакте с корнями растений и окружающих отложений. Используйте зажимы, чтобы закрепить пластины вместе и высушить внешние края салфеткой. Неоднократно добавляйте несколько капель воды в листья, чтобы сохранить растение гидратированных всей сборки ризо-сэндвич и использовать виниловую электрическую ленту, чтобы затянуть rhizo-сэндвич камеры.

Затем запечатать края с моделированием глины и дополнительной электрической лентой. Чтобы подготовиться к визуализации, удалите фольгу покрытия из области оптоды после инкубации и распоимите камеру ризо-сэндвича со стеклянной стеной с оптодом вертикально к стене аквариума. Используйте спейсер, чтобы прижмить камеру ризо-сэндвича к стене.

Поместите частоту домена на основе люминесценции срок службы камеры оснащены целью перед аквариумом и области интереса. Прикрепите подходящий фильтр выбросов для визуализации красителя индикатора к цели камеры и зафиксните световое руководство в источнике светодиодного возбуждения. Затем распоить руководство так, чтобы оно равномерно освещало планарную оптодовую фольгу, покрывающую область интереса.

В программном обеспечении для визуализации выберите камеру и выберите светодиод в программном обеспечении для управления светодиодами. Установите интенсивность светодиодов по мере необходимости и пометьте аналоговый и синхронизированный, чтобы подтвердить, что светодиод вызывается внешней транзистор-транзисторной логикой. Вручную сосредоточьте камеру и отрегулируйте объективную диафрагму и установите внутренний источник модуляции, синусовую волну для выходной формы волны, дополнительную фазовую выборку, восьмиступные образцы, фазовой порядок напротив, кран A B считывание и частоту модуляции пяти килогерца.

Отрегулируйте время экспозиции до тех пор, пока область статистики интересов для нормализованного изображения интенсивности люминесценции не будет в диапазоне от 0,68 до 0,72. Затем нажмите ссылку захвата, чтобы начать приобретение серии эталонных измерений. Для калибровки оптоды используйте газосмешивая устройство для промывки воды в калибровочном аквариуме с помощью газовой смеси окружающего воздуха с известной концентрацией кислорода, отслеживая концентрацию кислорода с помощью внешнего зонда с помощью датчика кислорода.

Затем приобрети ряд изображений в различных концентрациях кислорода в калибровочной камере, чтобы получить правильную кривую, пригодную для полученных данных калибровки. Когда система была откалибровлена, выключите свет, применяя облучение завода и всех других источников света и настроить время приобретения на основе интенсивности изображения, чтобы гарантировать, что сигнал не является ни перенасыщенным, ни слишком слабым для хорошего соотношения сигнала к шуму в определении продолжительности жизни. Когда все изображения продолжительности жизни кислорода были приобретены, включите свет обратно, чтобы получить структурное изображение и получить изображение с линейкой в поле зрения, чтобы позволить последующее масштабирование приобретенных изображений.

Перед визуализацией образца необходимо откалибровать оптод. После квази-экспоненциального распада, измеренная продолжительность жизни люминесценции уменьшается по мере увеличения концентрации кислорода. Эту взаимосвязь также можно описать с помощью упрощенной двухкоумной модели.

После того, как оптода была откалибровирована, можно определить концентрацию кислорода путем изображения люминесценции жизни, как это наблюдается на этих изображениях, в которых распределение концентрации кислорода в корневой сфере Littorella uniflora был изображен после воздействия света до 500 микромоле фотонов на метр в квадрате в секунду в течение 12 часов и после 12 часов в темноте. В дополнение к пожизненным изображениям, структурные изображения также могут быть приобретены под внешним освещением, сохраняя при этом геометрию изображения фиксированной, чтобы кислород изображения, чтобы быть точно коррелирует со структурным изображением. Профили концентрации кислорода в одном корне, например, могут быть извлечены из изображений, полученных в темноте и свете.

Очень важно иметь хороший контакт между матрицей образца и оптодом, чтобы избежать ненужных артефактов. Если вы сомневаетесь, переделать бутерброд. Мгновенное получение изображения неразрушающим образом позволяет контролировать кислородную среду.

Метод также может быть объединен с другими оптодесами для рН или других аналитов. Будьте уверены, чтобы выполнить изготовление опто в дым капот, как датчик коктейль содержит хлороформ. Планарные оптоды могут быть использованы для идентификации микробных сообществ в отложениях.

И после визуализации, сэндвич может быть открыт для образца этих горячих точек для анализа микробного сообщества.