3D Многоцветный инструмент ДНК FISH для изучения ядерной архитектуры в первичных клетках человека

3D многоцветная ДНК FISH представляет собой инструмент для визуализации нескольких геномных локусов в 3D сохранившихся ядрах, однозначно определяя их взаимные взаимодействия и локализацию в ядерном пространстве на уровне одной клетки. Здесь описывается протокол шаг за шагом для широкого спектра первичных клеток человека.

3D многоцветная ДНК FISH позволяет визуализировать множественные геномные локусы внутри сохранившихся ядер, чтобы неоднозначно определить их взаимное взаимодействие и локализацию на уровне одной клетки. 3D многоцветная ДНК FISH позволяет непосредственно изучат ядерную архитектуру. Как правило, он работает в сочетании с технологиями захвата хромосом, что делает метод доступным инструментом для проверки данных C в пределах отдельных клеток.

Демонстрацией процедуры будет Федерика Мараска. Она постдок в моей лаборатории. Начните с инкубации смеси ник перевода в тепловой смеситель при 16 градусов по Цельсию в зависимости от длины исходного материала ДНК.

В конце инкубации проверьте размер зондов на 2,2%агарозного геля. Для каждого эксперимента DNA FISH, осадок соответствующее количество зонда в соответствии со стартовым материалом ДНК, из которого зонды были произведены в 150 микролитров двойной дистиллированной воды, 20 микрограммов неолицеприятных ДНК спермы лосося, 3,5 микрограмма видов конкретных Cot-1 ДНК, три тома 100% этанола, и 1/10 объем трех молира ацета натрия в течение одного часа при температуре минус 80 градусов по Цельсию. В конце инкубации центрифуга образца на максимальной скорости в течение одного часа при четырех градусах по Цельсию.

После отказа от супернатанта, мыть гранулы два раза с 500 микролитров 70% этанола. После второй стирки, повторно гранулы в двух микролитров 100%formamide и встряхнуть зонд в течение 30 минут при 40 градусах по Цельсию, прежде чем добавить равный объем 4X солевого соляного цитрата в 20%dextran сульфат. Для фиксации предварительной обработки и пермеабилизации мелких клеток с небольшими ядрами и небольшим количеством цитоплазмы, сначала добавьте два раза 10 к шестым клеткам в 200 микролитров PBS непосредственно на стеклянные крышки в отдельных колодцах 24-хорошо пластины и позволяют клеткам осесть в течение 30 минут при комнатной температуре.

В конце инкубации, быстро заменить PBS с 300 микролитров свежеприготовленных 4%paraformaldehyde дополнен 0,1%Tween 20. Через 10 минут мыть фиксированные клетки три раза в 300 микролитров 0,05%TPBS в течение пяти минут на стирку при комнатной температуре. После последней стирки, permeabilize Т-клеток с 300 микролитров 0,5%TPBS в течение 10 минут при комнатной температуре перед лечением клеток с 250 микролитров на колодец RNAse коктейль разбавленной 1:100 в PBS в течение одного часа при температуре 37 градусов по Цельсию.

В конце инкубации, промыть клетки в 300 микролитров PBS и добавить 300 микролитров 20%глицерол в PBS к каждому хорошо с ночной инкубации при четырех градусах по Цельсию. На следующее утро поместите стекло на сухой лед на 15-30 секунд, чтобы заморозить клетки, прежде чем постепенно оттаивать образцы при комнатной температуре и замачивать их в 300 микролитров 20%глицерол в PBS в течение 30 секунд. После замораживания/ оттаивания клеток еще в три раза, как только что продемонстрировано, мыть образцы в 300 микролитров 0,5%TPBS в течение пяти минут при комнатной температуре, а затем две моет в 300 микролитров 0,05%TPBS в течение пяти минут на стирку при комнатной температуре.

После последней стирки обработать клетки 300 микролитров 0,1 нормальной соляной кислоты в течение 12 минут при комнатной температуре, а затем два полоскания в 300 микролитров солевого цитрата натрия. Затем исправить образцы на ночь в 300 микролитров 50%формамида в 2X солевой цитрат натрия при комнатной температуре. Для фиксации, предварительного лечения и проницаемки больших клеток с большим количеством цитоплазмы, исправить, предварительно лечить и проницать клетки так же, как попродемонстрировано для человека первичных Т-клеток и лечения образцов с 300 микролитров 0,0025%пепсин в 0,01 нормальной соляной кислоты в течение нескольких секунд до пяти минут.

Наблюдайте за клетками под оптическим микроскопом и остановите реакцию двумя пятиминутными мойки в 300 микролитров 50 миллимолярный хлорид магния, как только ядра свободны от цитоплазмы, но нуклеолы все еще видны и нетронутыми. Для 3D многоцветной ДНК FISH, денатурации гибридизации зондов при 80 градусов по Цельсию в течение пяти минут и сразу же разместить зонды на льду. Загрузите зонды на чистый слайд микроскопа и поместите одну крышку клеток на каждую каплю зонда.

Печать края крышки с резиновым цементом. Когда цемент полностью высохнет, денатурировать образцы на 75 градусов по Цельсию нагревательного блока. Через четыре минуты, гидрогидридизировать образцы при 37 градусов по Цельсию ночь в металлической коробке плавающей в водяной бане.

На следующее утро, снять резиновый цемент и со слайдами погружается в 2X солевой цитрат натрия тщательно снять крышки. Поместите каждый coverslip в отдельных скважин из шести скважин пластины, содержащей два миллилитров свежего солевого цитрата натрия на скважину в течение двух пяти минут моет при 37 градусов по Цельсию с встряхивания на 90 оборотов в минуту. В конце инкубации, промыть coverslips кратко в двух миллилитров 0,2%Tween 20 в 4X солевой цитрат натрия.

Для обнаружения 3D-многоцветной ДНК FISH перенесите крышки в отдельные скважины новой пластины из 24 скважин и блокируйте любые неспецифические привязки в 300 микролитров блокирующего буфера в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия и 20 революциях в минуту. В конце инкубации обработать образцы с соответствующей концентрацией анти-дигоксигенина и/или стрептавидина, разбавленного блокирующим буфером в течение 35 минут в темной и влажной камере при 37 градусах Цельсия. В конце инкубации перенесите образцы в отдельные скважины из шести скважин пластины и мыть образцы три раза в двух миллилитров 0,2%Tween 20 и 4X солевой цитрат натрия в течение пяти минут за стирку с тряской на 90 оборотов в минуту.

После последней стирки, equilibrate образцов в двух миллилитров PBS перед передачей coverslips на новый 24-хорошо пластины для пост-фиксации в 300 микролитров 2%формальдегида в PBS в хорошо в течение двух минут при комнатной температуре. Вымойте фиксированные клетки пять раз кратко в 300 микролитров PBS, а затем окрашивание с DAPI разбавленной на один нанограмм на миллилитр в 300 микролитров PBS в течение пяти минут при комнатной температуре. Вымойте крышки еще пять раз в PBS и смонтировать образцы с соответствующей крепления среды.

Затем приобретайте 3D-изображения с помощью микроскопной системы. 3D многоцветная ДНК FISH позволяет современную визуализацию различных геномных локусов в сохранившихся 3D ядрах. Для подготовки ДНК-зонда размер зонда менее 200 базовых пар обеспечивает успешную 3D многоцветную процедуру FISH ДНК.

Неоптимальные зонды ДНК FISH, производимые переводом ника, могут быть частично или переварены. Переваренные зонды приведут к неспецифическому сигналу из-за потери специфичности в гибридизации и последующего увеличения фона. Для человека первичных Т-лимфоцитов и небольших клеток с небольшими ядрами и небольшим количеством цитоплазмы, 12-минутный 0,1 нормального лечения соляной кислоты рекомендуется содействовать нуклей доступности ДНК зондов и сохранить ядерную целостность.

Цитоплазмическое пищеварение пепсин не требуется для получения ДНК FISH хороший сигнал в небольших клетках. Для человека первичных миобластов и клеток, которые имеют большие ядра и обильные цитоплазмы, однако, шаг пепсинизации имеет основополагающее значение. Короткая и неоптимальная цитоскелетная пепсинизация будет препятствовать проникновению зонда в ядра, заканчивающийся при отсутствии сигнала ДНК FISH.

Однако, если клетки чрезмерно пепсинизированы, ядра не останутся нетронутыми, теряя свою 3D структуру. Успешная 3D многоцветная ДНК FISH приведет к присутствию сигнала внутри ядер. Предлагаю работать со свежим биологическим материалом, тестировать зонды перед выполнением 3D многоцветной ДНК FISH, готовить свежие растворы и быть точным со временем инкубации и температурой.

Помните, что формамид и HCL являются опасными веществами и всегда должны использоваться в химическом дымовом капоте с соответствующими одноразовыми материалами.