Ковалентного связывания БМП-2 на поверхностях Использование самоорганизующихся монослоя подход

Общая цель этой процедуры заключается в ковалентном связывании двух молекул BMP с поверхностями без потери их биологической активности. Это достигается путем предварительного формирования слоя золота на подложке путем физического осаждения из газовой фазы. Вторым этапом является создание самоорганизующегося монослоя из бифункционального NHS-тиолового линкера mu NHSA.

Далее RH BMP two ковалентно связывается с линкером. Заключительным этапом является снятие несвязанной БМП два с помощью ультразвуковой обработки. В конечном счете, анализ связывания антител используется для того, чтобы показать успешное связывание BMP 2 с поверхностью, а биологическая активность поверхностно связанного BMP 2 определяется в клетках путем анализа фосфорилирования SMA 1 5 8.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии факторов роста, например, достаточно ли первоначального связывания факторов роста с их рецепторами на поверхности клетки для запуска сигнальных реакций. Демонстрировать процедуру будут два сотрудника моей лаборатории, Тереза Пол и Элизабет Шваб. Для начала этой процедуры очистите стекла от стекла прецизионными салфетками и пропитайте их ультразвуком в течение пяти минут смесью этилацетата и метанола один к одному.

После обработки ультразвуком промойте подложки метанолом и просушите их под потоком азота. Поместите чистые подложки в устройство для нанесения напыления и опорожните камеру. Удалите самый верхний слой оксида хрома с мишени хрома, распыляя в течение 60 секунд.

Затем покройте подложку слоем хрома толщиной 10 нанометров, а затем покройте слоем золота толщиной 40 нанометров. Когда закончите, извлеките золотые подложки из камеры и отложите их в сторону. Переложите золотые подложки в колбу с круглым дном с двумя горлышками и инкубируйте их в одном миллимоляре M-U-N-H-S в DMF при комнатной температуре в течение четырех часов в атмосфере азота.

После инкубации обрабатывайте субстраты ультразвуком в ДМФА в течение двух минут. Промойте их ДМФА и метанолом и высушите под потоком азота. Разбавьте двухстоковый раствор RHB MP с одним моляром натрия хлорида в PBS до получения конечной концентрации 3,5 мкг на миллилитр.

Отрегулируйте этот рабочий раствор до pH 8,5 с помощью стерильного 10 миллимолярного гидроксида калия непосредственно перед применением. Поместите кольцо A-P-D-M-S поверх образца. Перенесите субстрат на шестилуночную пластину, чтобы только поверхности субстрата подвергались воздействию инкубационного раствора.

Затем инкубируйте функционализированные субстраты M-U-N-H-S с рабочим раствором RHB MP two при четырех градусах Цельсия в течение ночи. После удаления надосадочной жидкости инкубации добавьте один моляр натрия хлорида в PBS и обработайте субстраты ультразвуком в течение двух минут. По окончании трижды промойте субстраты стерильным одним моляром хлорида натрия в PBS, чтобы блокировать неспецифическую абсорбцию антител.

Инкубируйте субстраты в 5% BSA в PBS в течение одного часа при комнатной температуре. Затем инкубируйте субстраты с раствором антител против BMP two в течение одного часа при комнатной температуре, когда закончите, дважды промойте субстраты PBS и обрабатывайте их ультразвуком в течение 30 секунд. Затем инкубируйте субстраты в конъюгированном растворе вторичного антитела HRP в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем дважды промойте их PBS.

Используйте анализ на грипп красный для измерения ферментативной активности HRP на глубине 570 нанометров с помощью планшетного ридера: затравка один раз по 10 раз в пятый рот C двух миобластов C 12 на лунку в шести луночных планшетах в питательной среде и инкубируйте их в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия и 5% CO2. После того, как планшеты были извлечены из инкубатора, аспирируйте среду из лунок и морите клетки голоданием в бессывороточном DMEM в течение трех-пяти часов перед посевом на функционализированные две поверхности субстрата BMP для исследования краткосрочной индукции сигналов. Замените среду 200 микролитрами свежего DMEM без сыворотки и поместите иммобилизованную BMP на два субстрата над клетками с помощью пинцета с тонким кончиком после инкубации при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.

Аккуратно удалите субстрат и аспирируйте среду с помощью пипетки. Затем дважды промывают клетки PBS и приступают к анализу клеточных реакций с помощью гель-электрофореза и вестерн-блоттинга для анализа долгосрочной биологической активности. Нанесите клетки на поверхности, как описано ранее, и культивируйте их при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в 2% FBS в течение шести дней.

После инкубации. Визуализируйте клетки с помощью флуоресцентной микроскопии для проверки RH BMP: две связывающие поверхности с иммобилизованным RH BMP, две были инкубированы с двумя специфическими антителами BMP и вторичным антителом, конъюгированным с HRP. Поверхностная иммобилизованная RH BMP two или I BMP two обнаруживалась до и после стимуляции клеток.

Здесь показано успешное связывание RH BMP two с поверхностью в подтверждении, распознаваемом противопехотной БМП 2 IgG. Поверхностный иммобилизованный RH BMP 2 был количественно определен с помощью метрического анализа amli flu red chole, и данные показывают, что после стимуляции клеток белок все еще обнаруживался на поверхности, реакции клеток на поверхности с иммобилизованным RHB MP 2 были оценены и сравнены с эффектом необработанных золотых субстратов. Здесь клетки C и C 12 стимулировались в течение 30 минут двумя функционализированными поверхностями RHB MP, приближающимися сверху.

В этой модели BMP 2 ингибирует дифференцировку клеток в многоядерные миопробирки и индуцирует фенотипы остеобластов. Активация SMAD 1, 5, 8, которые являются нисходящими репортерами сигнального пути BMP two, анализируется с помощью вестерн-блоттинга, как показано здесь. Фосфорилирование SM наблюдается после 30-минутной стимуляции I BMP two, в то время как фосфорилирование SMAD 1 58 не происходит в клетках, подвергшихся воздействию необработанных образцов золота.

Этот результат указывает на то, что процесс иммобилизации не изменяет краткосрочную активность BMP 2 и запускает ранние этапы передачи сигналов smad, чтобы определить, влияет ли I BM P two на долгосрочную остеогенную дифференцировку. Уровень экспрессии щелочной фосфатазы исследовали с помощью холеметрического анализа. Активность щелочной фосфатазы клеток C two C 12 измеряли после инкубации клеток в течение шести дней на обычном золоте и на двух поверхностях IBP.

Активность щелочной фосфатазы в лизатах клеток, культивируемых на двух поверхностях I БМ Р, показала достоверно более высокую абсорбцию по сравнению с контролем. Этот результат показывает, что IBMP two индуцирует экспрессию щелочной фосфатазы в клетках C two C 12 для исследования эффекта IBP 2. При миогенезе С две клетки С12 покрывали непосредственно на золоте или на функционализированных поверхностях и культивировали в условиях низкой концентрации сыворотки.

Через шесть дней было проведено окрашивание тяжелой цепи миозина, как показано здесь. Клетки C 2 C 12 не смогли образовать миозин с тяжелой цепью положительных миотрубков в присутствии I BM P two, в отличие от клеток на золотых субстратах. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как иммобилизация BMP 2 на наночастицах золота, чтобы ответить на дополнительные вопросы.

Например, сколько иммобилизованной БМП 2 необходимо локально для эффективного запуска сигнальных ответов.