Сбор и обработка данных нейтронной кристаллографии для моделирования атомов водорода в белковых структурах

Нейтронная кристаллография — это структурный метод определения положения атомов водорода в биологических макромолекулах. Нейтронные структуры выявляют состояния протонирования и ориентацию молекул воды, чтобы прояснить механизмы реакций и взаимодействий. В отличие от рентгеновской дифракции, нейтронная дифракция имеет преимущество в том, что является неразрушающим методом.

Белки со светочувствительными группами или металлосенсоры можно изучать без радиационного повреждения. Для проведения кристаллографии нейтронных белков крупные хрупкие кристаллы белка монтируются в кварцевые капилляры для сбора данных о комнатной температуре. Монтаж кристаллов в капилляры обычно не выполняется, что делает демонстрацию этой техники поучительной.

Для сбора кристаллов откройте герметичную коробку для сэндвичей, содержащую кристаллы белка в девятилуночной силиконизированной стеклянной пластине большого объема, и с помощью микропипетки переведите от 10 до 20 микролитров из раствора кристаллизационного резервуара на предметное стекло. Оцените кристаллы с помощью микроскопа. Используйте микропетлю соответствующего размера, чтобы собрать кристалл и поместить кристалл в каплю резервуарного раствора.

Для крепления кристалла возьмите кварцевый капилляр диаметром два миллиметра и длиной 50 миллиметров, отсадите буфер резервуара с помощью пипетки и заполните один конец капилляра буфером резервуара. Используйте монтажную петлю, чтобы аккуратно поместить кристалл в буфер резервуара внутри кварцевого капилляра. Постукивайте по трубке, чтобы переместить буфер резервуара и кристалл вниз по капилляру, и используйте длинную тонкую пипетку, чтобы отсасывать раствор вокруг кристалла.

С помощью тонкого бумажного фитиля тщательно высушите кристалл и стенки капилляра и добавьте от 20 до 50 микролитров дейтерированного буферного раствора на конец капилляра. С помощью тепловой палочки растопите порцию пчелиного воска и аккуратно вставьте капилляр в расплавленный пчелиный воск, пока не образуется герметичное уплотнение. Замените дейтерированный буфер 20-50 микролитрами свежего дейтерированного буфера на второй, шестой и 10-й дни после установки кристалла и повторно запечатайте капилляр свежерасплавленным пчелиным воском после каждого парообмена, как показано на рисунке.

По прошествии не менее двух недель парообмена с помощью шпатлевки закрепите кварцевый капилляр на палочке для образца гониометра нейтронного дифрактометра IMAGINE, которая была прикреплена к предметному столику прибора, опустите образец и вставьте его в область нейтронного пучка и детектора. Откройте программу сбора данных на управляющем компьютере Beamline и перейдите на вкладку настройки, чтобы настроить стратегию сбора данных и ввести параметры эксперимента, включая название прибора и название изображений, которые необходимо собрать. Перейдите на вкладку сбора и введите параметры сбора данных, включая время экспозиции и количество собираемых кадров.

В оптическом графическом пользовательском интерфейсе щелкните 2,78 для лямбда-минимума и 4,5 для лямбда-максимума, чтобы задать квазидиапазон для сбора данных. Нажмите кнопку «Начать сканирование», чтобы начать сбор данных. После сбора нейтронных данных соберите соответствующий набор рентгеновских данных на том же кристалле при той же температуре.

Перед сбором криоданных извлеките резервуарный раствор из сэндвич-бокса и заполните сэндвич-бокс дейтерированным буферным раствором, дайте уравновеситься в течение одной недели и повторите три раза. После еще трех раундов замены раствора резервуара соберите кристалл с помощью микропетли и погрузите кристалл в раствор криопротектора на два часа, прежде чем установить кристалл в микропетлю, прикрепленную к креплению криокристалла. Погрузите установленный кристалл и криомонт в жидкий азот.

Когда кристалл заморожен, установите кристалл на предметный столик для образца высокомолекулярного нейтронного дифрактометра, оснащенный криопотоком. Убедитесь, что кристалл установлен и отцентрирован для сбора данных, заполните информацию о предложении и щелкните значок папки, чтобы загрузить таблицу стратегии сбора данных, а затем нажмите кнопку «Отправить», чтобы начать сбор данных. Дифрагированные нейтроны станут видимыми в режиме реального времени по мере их обнаружения времяпролетными детекторами MaNDi.

Для совместного уточнения рентгеновских и нейтронных данных сначала откройте CCP4 и выберите «Конвертировать, чтобы изменить» расширить программу MTZ, чтобы привести флаги свободных данных R нейтронных данных в соответствие с рентгеновскими данными. Импортируйте файл отражения нейтронных данных в формат МТЗ. Выберите импорт бесплатных данных R из другого файла MTZ и импортируйте файл рентгеновского MTZ.

Назовите новый совпадающий файл MTZ и нажмите кнопку «Выполнить». Далее откройте программный пакет Phoenix и в разделе уточнения нажмите кнопку Ready set. Загрузите файл координат белка, выберите добавление водорода в модель, если он отсутствует, и выберите HD в заменяемых местах, H в другом месте из выпадающего меню.

Выберите «Добавить дейтерий в молекулы растворителя» и нажмите «Запустить», чтобы начать. Для уточнения структуры во вкладке уточнения откройте феникса. Программа уточнения для настройки уточнения с использованием рентгеновских и нейтронных данных.

На вкладке configure введите PDB-файл из расчетной рентгеновской структуры. Загрузите файл МТЗ из нейтронных данных. Назначьте данные файла МТЗ как нейтронные данные в Neutron R free.

Загрузите файл MTZ из рентгеновских данных и назначьте его как рентгеновские данные и x-ray R free. В разделе Настройки уточнения убедитесь, что выбрана стандартная стратегия уточнения, и увеличьте количество циклов до пяти. Выберите все параметры, расширенные и водородные.

Измените модель очистки водорода на индивидуальную и отключите силовую езду на ADP, затем ищите ядерный. Выберите использовать ядерные расстояния от X-HD. Нажмите кнопку «Выполнить», чтобы начать уточнение.

Для создания модели в Phoenix нажмите кнопку «Открыть» в Coot. В Coot визуализируйте карты плотности рентгеновских электронов и плотности длины рассеяния нейтронов. Выберите диспетчер отображения и удалите карту плотности длины нейтронного рассеяния 2FOFC.

Выберите «Открыть MTZ» и выберите «Открыть MTZ» и откройте файл с нейтронными данными MTZ. Для опций амплитуд и фаз выберите no_fill_neutron данные из раскрывающихся меню, чтобы открыть карты плотности длины рассеяния нейтронов без заполненных данных. Выполните визуальный осмотр остатков, чтобы определить, соответствует ли модель данным, и проанализируйте карту разницы плотностей, пики водородно-дейтериевых обменных участков, чтобы определить правильную ориентацию и занятость.

Переориентация молекул воды в соответствии с нейтронными SLD-картами и взаимодействиями водородных связей. Отрегулируйте состояние протонирования и ориентацию белковых остатков водород-дейтериевых обменных центров в соответствии с нейтронными SLD-картами. Выполните дальнейшие раунды интерактивного построения и уточнения модели для получения полной структуры.

Кристаллы гидрогенизированного белка, выращенные в буфере на водной основе, имеют размеры примерно 1000 на 900 микрон. Кристаллы могут быть установлены в кварцевые капилляры для парообмена с буфером на основе оксида дейтерия за три недели до сбора данных о дифракции нейтронов. Данные нейтронной дифракции собирались в течение нескольких дней с разрешением 2,30 ангстрема, и на том же кристалле был собран набор данных рентгеновской дифракции.

Пики в картах плотности длины рассеяния нейтронов FO минус FC дают ценную информацию об ориентации остатков, таких как спарагин, и положительные пики в картах плотности плотности рассеяния нейтронов FO минус FC также очень информативны при определении состояний протонирования остатков с титруемыми группами, такими как гистидин. Наложение карт длины рассеяния электронов и нейтронов для молекул воды показывает, что в то время как взаимодействия водородных связей могут быть выведены из рентгеновских данных, нейтроны предоставляют четкую информацию о положениях этих водородных связей. Для определения ориентации функциональных групп боковых групп водородно-дейтериевой боковой цепи можно использовать карты пропуска длины рассеяния нейтронов.

Карты плотности длины рассеяния нейтронов, в которых необменные атомы водорода связаны с углеродом, кажутся неполными по сравнению с их аналогами карты электронной плотности из-за подавления плотности. Поэтому предпочтительно проводить совместное уточнение образца с использованием как рентгеновских, так и нейтронных данных, при котором рентгеновские данные могут быть использованы для определения положения белкового остова белка. Для кристаллографии нейтронных белков требуются крупные кристаллы.

Следует соблюдать осторожность при работе с кристаллами и их монтаже, чтобы не повредить кристаллы, которые могут легко треснуть, что поставит под угрозу качество данных. Кристаллография нейтронных белков дает представление о механизме белковой реакции, потенциально выявляя каталитически значимые остатки или молекулы воды, роль которых может быть дополнительно исследована с помощью кинетики, мутагенеза или спектроскопии.