Name: Выделение активного caenorhabditis elegans Nuclear Extract и восстановление для транскрипции in vitro (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Узнайте метод выделения функционально активного ядерного экстракта из Caenorhabditis elegans для исследования транскрипции in vitro. Этот протокол расширяет возможности использования C. elegans в биохимических исследованиях.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа была поддержана грантом NIH MIRA (R35GM124678 для J. S.).

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+window+into+biology%3A+A+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Blackwell, T. K., Walker, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription mechanisms.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-16 (2006).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">The cuticle.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-15 (2007).</li>
<li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+properties+of+the+Caenorhabditis+elegans+TATA-box-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).</li>
<li>Lichtsteiner, S., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+activation+of+transcription+by+UNC-86+and+MEC-3+in+Caenorhabditis+elegans+embryo+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts.</a> EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).</li>
<li>Shan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope-labeled+immunoassays+without+radiation+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isotope-labeled immunoassays without radiation waste.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).</li>
<li>Voss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+non-radioactive+eukaryotic+in+vitro+transcription+assay+for+sensitive+quantification+of+RNA+polymerase+II+activity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity.</a> BMC Molecular Biology. 15, 7(2014).</li>
<li>Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+Caenorhabditis+elegans+transcription+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87(2020).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-11 (2006).</li>
<li>Zbacnik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+buffers+in+protein+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of buffers in protein formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).</li>
</ol>

У авторов нет конкурирующих интересов для раскрытия.

C. elegans является привлекательным модельным организмом для изучения системы эукариотической транскрипции из-за ее недорогого обслуживания и простоты генетических манипуляций. Здесь описан протокол последовательного выделения функционально активного ядерного экстракта из L4 C. elegans. Хотя этот протокол был сосредоточен на визуализации транскрипционной активности, кДНК, полученная посттранскрипционно, может быть количественно определена с использованием RT-qPCR для получения более точного измерения ак...

Маленькая, свободно живущая нематода Caenorhabditis elegans является простым, но мощным модельным организмом для решения широкого круга биологических вопросов. С момента своего появления в 1963 году нематоды были бесценны для ответа на вопросы в нейробиологии, метаболизме, старении, развитии, иммунитете и генетике1. Некоторые из многих характеристик животного, которые делают его идеальным модельным организмом, включают короткое время генерации, эффективность РНК-интерференции, прозрачное тело и завершенные карты как его клеточной линии, так и нервной системы.
Хотя вклад нематод в науку огромен, они были недостаточно использованы для выяснения системы транскрипции эукариот, причем большая часть нашего понимания этих механизмов исходит из исследований с использованием ядерного экстракта дрожжей, плодовой мухи и культуры клеток млекопитающих2. Самым большим препятствием, которое отговаривает исследователей от извлечения функционального ядерного экстракта, является жесткая внешняя кутикула нематоды. Этот экзоскелет содержит сшитые коллагены, кутиклины, гликопротеины и липиды, что делает C. elegans от личиночной стадии до взрослой жизни устойчивыми к экстракции белка с помощью химических или механических сил3. Система транскрипции in vitro с использованием ядерного экстракта C. elegans была когда-то разработана, но не получила широкого распространения из-за ограниченного объема системы, и использование гомогенизатора Dounce для приготовления экстракта может привести к нестабильности белка4,5.
В отличие от предыдущего протокола для изоляции ядерного экстракта, в котором использовался гомогенизатор Dounce для разрушения C. elegans, этот протокол использует гомогенизатор Balch. Гомогенизатор Balch состоит из двух основных компонентов: шарика из карбида вольфрама и блока из нержавеющей стали с каналом, просверленным от одного конца до другого. Гомогенизатор Balch загружается шариком из карбида вольфрама и закрывается с обеих сторон для герметизации шлифовальной камеры. Шприцы могут быть загружены на два вертикальных порта, ведущих в шлифовальную камеру. Когда материал передается от одного шприца к другому через шлифовальную камеру, давление от шприцев заставляет материал проходить через узкий зазор между шаром и стенкой камеры. Это медленное и постоянное давление разрушает материал, пока он не достигнет постоянного размера, который способен легко проходить через узкий зазор. Заставляя C. elegans проходить через узкую щель с помощью постоянного, но мягкого давления, животные открываются, выпуская их содержимое в окружающий буфер. Переключение размеров шарика еще больше затягивает зазор, разрывая вновь высвобождаемые клетки и освобождая ядра в буфер. Многочисленные случаи центрифугирования отделяют ядра от остального клеточного мусора, что позволяет собирать чистый ядерный экстракт. Гомогенизатор Balch предпочтительнее гомогенизатора Dounce по нескольким причинам: система может обрабатывать большое количество животных, что позволяет извлекать большое количество активных белков за одну попытку; точная обработка шариков и стального блока обеспечивает последовательное шлифование между несколькими образцами; тяжелый стальной блок действует как радиатор, равномерно отводя тепло от шлифовальной камеры, предотвращая денатурацию.
После выделения транскрипционная активность ядерного экстракта должна быть проверена перед использованием в любых биохимических экспериментах. Традиционно активность транскрипции измеряли с использованием меченых радиоактивными нуклеотидами для отслеживания и визуализации вновь синтезированной РНК. Однако радиоактивная маркировка может быть обременительной, поскольку она требует предосторожности во время использования и удаления6. Технологические достижения позволяют исследователям сегодня использовать гораздо менее вредные или неприятные методы для измерения даже небольших количеств РНК с использованием таких методов, как количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)7. Здесь протокол описывает метод выделения активного ядерного экстракта из личиночной стадии 4 (L4) C. elegans и визуализации транскрипционной активности в системе in vitro.

<table><tbody><tr><td><сильно>Расходные материалы и реагенты</сильные></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 мл 8-полосковые пробирки и Плоские полосатые колпачки, прозрачные Genesee</td><td>Scientific</td><td>&nbsp; 24-706</td><td></td></tr><tr><td>0,2 мл Индивидуальные ПЦР-пробирки</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 24-153G</td><td></td></tr><tr><td>1,7 мл стерильные микропробирки</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-282S</td><td></td></tr><tr><td>100% абсолютный молекулярный этанол</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; BP2818</td><td></td></tr><tr><td>100% этанол, Koptec</td><td>Decon Labs</td><td>&nbsp; V1001</td><td></td></tr><tr><td>10 мл серологическая пипетка</td><td>VWR international</td><td>&nbsp; 89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Пластины Петри 150 мм</td><td>Tritech Research</td><td>&nbsp; T3325</td><td></td></tr><tr><td>Конические центрифужные пробирки 15 мл</td><td>Genesee Scientific</td><td>&nbsp; 28-103</td><td></td></tr><tr><td>Пластиковые шприцы 20 мл</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955460</td><td></td></tr><tr><td>2 мл Шприцы Norm-Ject</td><td>Henke-Sass Wolf</td><td>GmbH 4020</td><td></td></tr><tr><td>500 мл вакуумный фильтрующий стакан 0,22 &; m PES, Stericup Millipore Express Plus</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCGPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>50 мл конические центрифужные пробирки</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>50 мл серологические пипетки</td><td>VWR international</td><td>&nbsp; 89130-902</td><td></td></tr><tr><td>Серологическая пипетка 5 мл</td><td>VWR international</td><td> 89130-896</td><td></td></tr><tr><td>Агар, Criterion</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; C7432</td><td></td></tr><tr><td>Агароза</td><td>Денвилл Научный</td><td>&nbsp; CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Маркер для защиты от алкоголя</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 52877-310</td><td></td></tr><tr><td>Бактопептон</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 90000-264</td><td></td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans</td><td>CGC</td><td>N2</td><td></td></tr><tr><td>Дихлорид кальция</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; C4901</td><td></td></tr><tr><td>Холестерин</td><td>многопоровый сигма</td><td>&nbsp; C8667</td><td></td></tr><tr><td>Контрольные праймеры для клонирования храма ДНК, Forward 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg tcg atc cgg gc -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Контрольные праймеры для клонирования храма ДНК, Forward 5'- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Деионизированная вода</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Дитиотреитол</td><td>Инвитроген</td><td>&nbsp; 15508-013</td><td></td></tr><tr><td>ДНК гелевая краска, безопасная для SYBR</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; S33102</td><td></td></tr><tr><td>Лестничная смесь DNA, O' линейка генов</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; SM1173</td><td></td></tr><tr><td>Краситель для загрузки ДНК, 6x TriTrack</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; </td><td></td>FERR1161</tr><tr><td>DNase, Baseline-ZERO</td><td>Lucigen</td><td>&nbsp; </td><td></td>DB0715K</tr><tr><td>Сухой лед</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli штамм OP50</td><td>CGC</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Ледяная уксусная кислота</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; А38</td><td></td></tr><tr><td>Глицерин</td><td>Многопоровый Сигма</td><td>&nbsp; G6279</td><td></td></tr><tr><td>Система транскрипции ядерного экстракта HeLa in vitro, HeLaScribe</td><td>Promega</td><td>&nbsp; E3110</td><td></td></tr><tr><td>Раствор Hepes, 1 м Gibco</td><td>Millipore Sigma</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>соляной кислотой 37%</td> <td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P0662</td><td></td></tr><tr><td>Гипохлоритный отбеливатель</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Бульон</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; L3022</td><td></td></tr><tr><td>Дихлорид магния</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; M8266</td><td></td></tr><tr><td>Сульфат магния</td><td>с миллипорами Sigma</td><td>&nbsp; M7506</td><td></td></tr><tr><td>Тарелки среднего веса</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 02-202-101</td><td></td></tr><tr><td>предметные стекла для микроскопа, Vista vision</td><td>VWR International</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>молекулярная вода, Hypure</td><td>Hyclone Laboratories</td><td>&nbsp; </td><td></td>SH30538</tr><tr><td>Нистатин</td><td>Миллипор Сигма</td><td>&nbsp; N1638</td><td></td></tr><tr><td>ПЦР-система, FailSafe с премиксом A</td><td>Lucigen</td><td>&nbsp; </td><td></td>FS99100</tr><tr><td>Хлорид калия</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P39111</td><td></td></tr><tr><td>Двухосновной фосфат калия</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P3786</td><td></td></tr><tr><td>Фосфат калия одноосновной</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; P0662</td><td></td></tr><tr><td>Ингибитор протеазы, Halt одноразовый коктейль 100x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>набор для анализа белка, Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; Q33211</td><td></td></tr><tr><td>набор для обратной транскрипции, Sensiscript</td><td>Qiagen</td><td>205211</td><td></td></tr><tr><td>набор для экстракции РНК RNeasy микронабор</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Ингибитор РНКазы</td><td>Applied Biosystems</td><td>&nbsp; </td><td></td>N8080119</tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; BDH9286-12 кг</td><td></td></tr><tr><td>Гидроксид натрия</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; 1-09137</td><td></td></tr><tr><td>Стерильный шприцевой фильтр с 0,2 мк; m Полиэфирсульфоновая мембрана</td><td>VWR international</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Сахароза</td><td>VWR International</td><td>&nbsp; 200-334-9</td><td></td></tr><tr><td>транскрипционные праймеры, Forward 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>праймеры для транскрипции, Reverse 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Трис-Бейс</td><td>Фишер Научный</td><td>&nbsp; BP152</td><td></td></tr><tr><td>Твин 20</td><td>миллипор Сигма</td><td>&nbsp; P2287</td><td></td></tr><tr><td>Оборудование</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 &deg; C инкубатор</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20&deg; C инкубатор</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&deg; C инкубатор</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C холодильник</td><td>ThermoFisher Scientific-80</td><td></td><td></td></tr>&<tr><td>deg; C морозильная камера</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balch гомогенизатор, гомогенизатор клеток isobiotec</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Настольный вихревой аппарат</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>центрифуга, Eppendorf 5418 R</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>центрифуга, VWR Clinical 50</td><td>VWR International</td><td>82013-800</td><td></td></tr><tr><td>Диссекционный микроскоп, Leica M80</td><td>Флуориметр Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Гелевая система визуализации, iBright FL1500</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; A44241</td><td></td></tr><tr><td>Гелевая система</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>VWR International</td><td>12621-048</td><td></td></tr><tr><td>Микроцентрифуги, Eppendorf 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY ACU 2</td><td>Integra</td><td>155017</td><td></td></tr><tr><td>Пипетка L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>пипетка L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014388</td><td></td></tr><tr><td>пипетка L-200 XLS+, пипетка Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>пипетка L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>платформа-качалка</td><td>VWR International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro</td><td>Eppendorf</td><td>950030010</td><td></td></tr></tbody></table>

Выделение активного caenorhabditis elegans nuclear extract и восстановление для транскрипции in vitro

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans является важной модельной системой для биологических исследований с тех пор, как она была введена в 1963 году. Однако C. elegans не был полностью использован в биохимическом исследовании биологических реакций с использованием его ядерных экстрактов, таких как транскрипция in vitro и репликация ДНК. Значительным препятствием для использования C. elegans в биохимических исследованиях является разрушение толстой внешней кутикулы нематоды без ущерба для активности ядерного экстракта. Хотя для разрушения кутикулы используется несколько методов, таких как гомогенизация Dounce или обработка ультразвуком, они часто приводят к нестабильности белка. Не существует установленных протоколов выделения активных ядерных белков из личинок или взрослых C. elegans для реакций in vitro . Здесь протокол подробно описывает гомогенизацию личинок стадии 4 C. elegans с использованием гомогенизатора Balch. Гомогенизатор Balch использует давление, чтобы медленно проталкивать животных через узкую щель, разрывающую кутикулу в процессе. Однородная конструкция и точная обработка гомогенизатора Balch обеспечивают последовательное измельчение животных между экспериментами. Фракционирование гомогената, полученного из гомогенизатора Балха, дает функционально активный ядерный экстракт, который может быть использован в методе in vitro для анализа транскрипционной активности C. elegans.

Следуя описанным шагам, следует получить функциональный ядерный экстракт (рисунок 1), отклонение на этапах измельчения или промывки может привести к плохой активности или низкому выходу. Если получен функциональный ядерный экстракт C. elegans , он будет транскрибировать область ниже по течению от промотора ЦМВ на шаблоне ДНК при добавлении к ранее описанному анализу in vitro . Полученный транскрипт РНК может быть очищен от ядерных белков и ...

Здесь мы опишем подробный протокол выделения активного ядерного экстракта из личиночной стадии 4 C. elegans и визуализации транскрипционной активности в системе in vitro .

Выделение активного caenorhabditis elegans Nuclear Extract и восстановление для транскрипции in vitro

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Этот протокол заполняет технический пробел для биохимического изучения C.elegans и расширяет их полезность в качестве модельного организма. Этот метод является простым и надежным, что позволяет последовательно выделять функционально активный ядерный экстракт C.elegans. Начните с размещения синхронизированных животных L1 на 10 150-миллиметровых пластинах, содержащих питательные среды нематод, засеянных Escherichia coli OP50, и позвольте животным расти в течение 48 часов при 20 градусах Цельсия, пока они не достигнут стадии L4.После того, как гипотонические и гипертонические буферы подготовлены, очистите гомогенизатор Balch, затопив камеру измельчения 70% этанолом. Затем промойте камеру деионизированной водой, чтобы удалить избыток этанола. Вставьте шарик из карбида вольфрама в шлифовальную камеру.Закройте концы ствола гомогенизатора Balch и закрепите крышки с помощью прилагаемых винтов. Затем подготовьте пять миллилитров полного гипотонического и гипертонического буферов на образец, как описано в тексте рукописи. Затем заполните стерильный двухмиллилитровой шприц одним миллилитром полного гипотонического буфера и осторожно промывайте шлифовальную камеру гомогенизатора Балха, оставив в камере примерно 500 микролитров полного гипотонического буфера.Храните промытый гомогенизатор на льду и дайте ему остыть в течение 30 минут. Соберите сытых животных L4 с буфером M9 в 15-миллилитровую коническую трубку и центрифугируйте животных по 1000 раз в г в течение трех минут. Удалите супернатант и продолжайте мыть гранулы животного до тех пор, пока супернатант не станет прозрачным.Затем промыть животных тремя миллилитрами холодного гипотонического буфера и снова центрифугой, как показано. После удаления надводного гипотонического буфера добавьте один миллилитр полного гипотонического буфера к грануле животного и перенесите суспензию животного в новый стерильный двухмиллилитровой шприц. Для гомогенизации животных, содержащихся на льду, осторожно протолкните животных через шлифовальную камеру гомогенизатора Balch, загруженного вольфрамовым шариком.Затем соберите животных обратно в шприц и повторите эту процедуру 30 раз. После 30 циклов гомогенизации соберите максимальную суспензию животного из гомогенизатора Balch и храните шприц с наконечником, расположенным вниз внутри 1,7-миллилитровой микротрубки. Извлеките вольфрамовый шарик и очистите шлифовальную камеру деионизированной водой.Высушите и верните шарик в соответствующую маркированную трубку. Затем вставьте вольфрамовый шарик диаметром 7,9880 миллиметра и зазором 12 микрометров в шлифовальную камеру и повторно запечатайте гомогенизатор. Снова промыть камеру измельчения одним миллилитром ледяного полного гипотонического буфера.Измельчите суспензию 25 раз, как показано на рисунке. Переложите суспензию животного в чистую 1,7-миллилитровую микропробирку и храните суспензию на льду. Наносите удары по телам животных и мусору путем центрифугирования.Пипетка 40 микролитров супернатанта в трубку, помеченную как входная фракция, и храните фракцию на льду. Перенесите оставшийся супернатант в новую 1,7-миллилитровую трубку, не нарушая гранулу, и центрифугу для гранулирования ядер. Затем перенесите супернатант, не нарушая гранулированные ядра, в новую 1,7-миллилитровую трубку, помеченную как цитозольная фракция.Чтобы промыть гранулу ядер, добавьте в гранулу 500 микролитров полного гипотонического буфера, суспендируйте гранулу и центрифугируйте в 4000 раз в г при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. В конце центрифугирования повторно суспендируют ядерную гранулу в 500 микролитрах свежего полного гипотонического буфера и снова центрифугируют образец, как показано на рисунке. Затем растворить гранулу в 40 микролитрах полного гипертонического буфера.Перенесите ядерную суспензию в новую 1,7-миллилитровую трубку с маркировкой ядерной фракции и храните ее на льду. Определите концентрацию белка в трех фракциях с помощью флуоресцентного количественного набора. Аликвотирование ядерных фракций в одноразовые пробирки, содержащие шесть микрограммов ядерного белка, и мгновенная заморозка в ванне с сухим льдом и этанолом.Храните образцы при температуре минус 80 градусов цельсия до дальнейшего использования. Репрезентативное изображение геля показывает продукты транскрипции ядерного экстракта личинок Caenorhabditis elegans L4 с использованием шаблона ДНК промотора ЦМВ. Успешная изоляция активных ядерных белков привела к созданию полосы 132 пар оснований после транскрипции in vitro, а неудачная изоляция привела к слабой полосе или отсутствию полосы.Не забудьте четко обозначить полные буферы. Неподходящие буферы могут нанести вред функциональности ядерных белков. Кроме того, держите гомогенизатор ледяным холодным, чтобы предотвратить денатурацию белков.Разработка этого метода позволила исследователям измерить скорость транскрипции РНК C.elegans во время стрессовых условий, показав, что скорость транскрипции животного может изменяться в зависимости от условий окружающей среды.

isolation-active-caenorhabditis-elegans-nuclear-extract

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Биохимия

Протокол выделения и активации сперматиды от...

Выделение и В пробирке Активация Caenorhabditis Элеганс Сперма

Этот протокол описывает подготовку синтетический субстрат для...

В пробирке тРНК метилирования Пробирной с Entamoeba histolytica ДНК и тРНК метилтрансферазы Dnmt2 (Ehmeth) Фермент

Microarray анализ был проведен для определения генетических профилей выражение...

Определение генетических профилей выражения в С. Элеганс Использование Microarray и ПЦР в реальном времени

Здесь мы приводим протокол для анализа РНК / белковые взаимодействия. Сдвиг анализа электрофоретической подвижности (EMSA) основан на дифференциальной миграции РНК / белковые комплексы и свободной РНК в процессе электрофореза нативного гель. При использовании радиоактивно помеченных РНК-зонда, РНК / белковые комплексы могут быть визуализированы с помощью авторадиографии.

Электрофоретической подвижности сдвига анализа (EMSA) по изучению РНК-белковых взаимодействий: ИРЭ / IRP примера

Этот протокол описывает изучение клеточных процессов клетки судьба в процессе преобразования Caenorhabditis elegans в естественных условиях. Использование трансгенных животных, позволяя теплового шока промоутер driven гиперэкспрессия нейрон вызывая судьба транскрипционного фактора ЧЕ-1 и опосредованного системой РНК-интерференции истощение хроматина регулирующий фактор Лин-53 зародышевых клеток для перепрограммирования нейрон может наблюдаться в естественных условиях.<br...

Применение РНК-интерференции и тепло шок индуцированной выражение фактор транскрипции для перепрограммирования клетки семенозачатка нейронов в C. elegans

Описывается процедура изоляции тандем РНК (поездка) для восстановления эндогенно сформированных мРНК белковых комплексов. Конкретно комплексы РНК белок, сшитыми в естественных условиях, polyadenylated РНК, изолированы от выдержки с oligo(dT) бусы, и частности mRNAs фиксируются с модифицированных олигонуклеотидов Антисмысловые РНК. Белки, привязан к мРНК распознаются immunoblot анализа.

Процедура изоляции на основе олигонуклеотида тандем РНК для восстановления эукариотические мРНК белковых комплексов

Здесь мы представляем собой протокол для изоляции РНК, ДНК и белка из того же образца, в попытке уменьшить вариации, улучшить воспроизводимость и облегчения толкования.

Комбинированные нуклеотидов и экстракции белка в Caenorhabditis elegans

Здесь мы представляем протокол для простой изоляции конкретных групп живых нейрональных клеток, выражающих зеленый флуоресцентный белок из трансгенных линий Caenorhabditis elegans.  Этот метод позволяет различные исследования ex vivo сосредоточены на конкретных нейронов и имеет возможность изолировать клетки для дальнейшего краткосрочного культивирования.

Изоляция конкретных популяций нейронов от roundworm Caenorhabditis elegans

Этот метод описывает протокол для высокопровереного приготовления экстракта белка из образцов Caenorhabditis elegans и последующей ко-иммунопреципиентации.

Приготовление экстракта белка и ко-иммунопреципиентация от Caenorhabditis elegans

Здесь представлено описание простого и относительно быстрого выделения геномной ДНК Caenorhabditis elegans от одного или нескольких животных с использованием коммерчески доступного набора тканей. Полученный препарат гДНК является подходящим шаблоном для ПЦР.

Мелкомасштабная экстракция геномной ДНК Caenorhabditis elegans

Настоящий протокол описывает методы добавления липидов в жидких и пластинчатых культурах для Caenorhabditis elegans в сочетании с продольными исследованиями и анализом транскрипции генов из объемных или нескольких червей и тканей червей.

Липидные добавки для долголетия и транскрипционного анализа генов при caenorhabditis elegans

Узнайте метод выделения функционально активного ядерного экстракта из Caenorhabditis elegans для исследования транскрипции in vitro. Этот протокол расширяет возможности использования C. elegans в биохимических исследованиях.

Выделение активного caenorhabditis elegans Nuclear Extract и восстановление для транскрипции in vitro

Больше видео