Выделение активного caenorhabditis elegans Nuclear Extract и восстановление для транскрипции in vitro

Здесь мы опишем подробный протокол выделения активного ядерного экстракта из личиночной стадии 4 C. elegans и визуализации транскрипционной активности в системе in vitro .

Этот протокол заполняет технический пробел для биохимического изучения C.elegans и расширяет их полезность в качестве модельного организма. Этот метод является простым и надежным, что позволяет последовательно выделять функционально активный ядерный экстракт C.elegans. Начните с размещения синхронизированных животных L1 на 10 150-миллиметровых пластинах, содержащих питательные среды нематод, засеянных Escherichia coli OP50, и позвольте животным расти в течение 48 часов при 20 градусах Цельсия, пока они не достигнут стадии L4.

После того, как гипотонические и гипертонические буферы подготовлены, очистите гомогенизатор Balch, затопив камеру измельчения 70% этанолом. Затем промойте камеру деионизированной водой, чтобы удалить избыток этанола. Вставьте шарик из карбида вольфрама в шлифовальную камеру.

Закройте концы ствола гомогенизатора Balch и закрепите крышки с помощью прилагаемых винтов. Затем подготовьте пять миллилитров полного гипотонического и гипертонического буферов на образец, как описано в тексте рукописи. Затем заполните стерильный двухмиллилитровой шприц одним миллилитром полного гипотонического буфера и осторожно промывайте шлифовальную камеру гомогенизатора Балха, оставив в камере примерно 500 микролитров полного гипотонического буфера.

Храните промытый гомогенизатор на льду и дайте ему остыть в течение 30 минут. Соберите сытых животных L4 с буфером M9 в 15-миллилитровую коническую трубку и центрифугируйте животных по 1000 раз в г в течение трех минут. Удалите супернатант и продолжайте мыть гранулы животного до тех пор, пока супернатант не станет прозрачным.

Затем промыть животных тремя миллилитрами холодного гипотонического буфера и снова центрифугой, как показано. После удаления надводного гипотонического буфера добавьте один миллилитр полного гипотонического буфера к грануле животного и перенесите суспензию животного в новый стерильный двухмиллилитровой шприц. Для гомогенизации животных, содержащихся на льду, осторожно протолкните животных через шлифовальную камеру гомогенизатора Balch, загруженного вольфрамовым шариком.

Затем соберите животных обратно в шприц и повторите эту процедуру 30 раз. После 30 циклов гомогенизации соберите максимальную суспензию животного из гомогенизатора Balch и храните шприц с наконечником, расположенным вниз внутри 1,7-миллилитровой микротрубки. Извлеките вольфрамовый шарик и очистите шлифовальную камеру деионизированной водой.

Высушите и верните шарик в соответствующую маркированную трубку. Затем вставьте вольфрамовый шарик диаметром 7,9880 миллиметра и зазором 12 микрометров в шлифовальную камеру и повторно запечатайте гомогенизатор. Снова промыть камеру измельчения одним миллилитром ледяного полного гипотонического буфера.

Измельчите суспензию 25 раз, как показано на рисунке. Переложите суспензию животного в чистую 1,7-миллилитровую микропробирку и храните суспензию на льду. Наносите удары по телам животных и мусору путем центрифугирования.

Пипетка 40 микролитров супернатанта в трубку, помеченную как входная фракция, и храните фракцию на льду. Перенесите оставшийся супернатант в новую 1,7-миллилитровую трубку, не нарушая гранулу, и центрифугу для гранулирования ядер. Затем перенесите супернатант, не нарушая гранулированные ядра, в новую 1,7-миллилитровую трубку, помеченную как цитозольная фракция.

Чтобы промыть гранулу ядер, добавьте в гранулу 500 микролитров полного гипотонического буфера, суспендируйте гранулу и центрифугируйте в 4000 раз в г при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. В конце центрифугирования повторно суспендируют ядерную гранулу в 500 микролитрах свежего полного гипотонического буфера и снова центрифугируют образец, как показано на рисунке. Затем растворить гранулу в 40 микролитрах полного гипертонического буфера.

Перенесите ядерную суспензию в новую 1,7-миллилитровую трубку с маркировкой ядерной фракции и храните ее на льду. Определите концентрацию белка в трех фракциях с помощью флуоресцентного количественного набора. Аликвотирование ядерных фракций в одноразовые пробирки, содержащие шесть микрограммов ядерного белка, и мгновенная заморозка в ванне с сухим льдом и этанолом.

Храните образцы при температуре минус 80 градусов цельсия до дальнейшего использования. Репрезентативное изображение геля показывает продукты транскрипции ядерного экстракта личинок Caenorhabditis elegans L4 с использованием шаблона ДНК промотора ЦМВ. Успешная изоляция активных ядерных белков привела к созданию полосы 132 пар оснований после транскрипции in vitro, а неудачная изоляция привела к слабой полосе или отсутствию полосы.

Не забудьте четко обозначить полные буферы. Неподходящие буферы могут нанести вред функциональности ядерных белков. Кроме того, держите гомогенизатор ледяным холодным, чтобы предотвратить денатурацию белков.

Разработка этого метода позволила исследователям измерить скорость транскрипции РНК C.elegans во время стрессовых условий, показав, что скорость транскрипции животного может изменяться в зависимости от условий окружающей среды.