Исследования взаимодействия шаперон-кочаперон с использованием гомогенного бисероплетения
21 июля 2021 г.
Этот протокол представляет собой метод исследования белково-белковых взаимодействий с использованием глутатион-связанных донорских шариков с GST-сплавленными TPR-мотив-ко-шаперонами и акцепторными шариками в сочетании с пептидом, полученным из Hsp90. Мы использовали этот метод для скрининга небольших молекул для нарушения взаимодействий Hsp90-FKBP51 или Hsp90-FKBP52 и идентифицировали мощные и селективные ингибиторы взаимодействия Hsp90-FKBP51.
Мы построили однородный анализ на основе бисера для изучения взаимодействия шаперон-кохаперон. Используя этот метод, мы проверяем небольшие молекулы, ингибирующие взаимодействия между Hsp90 и FKDP51 или FKBP52, и идентифицируем мощные и селективные ингибиторы. Этот высокопроизводительный метод скрининга является надежным и надежным.
Результаты могут быть получены в течение одного часа, и для этого требуется лишь небольшое количество белка и соединений бусин. Взаимодействие Hsp90 с этим кохапероном было связано с расстройствами человека, такими как болезнь Альцгеймера, рак, аутоиммунные заболевания. Данная методика дает возможность скрининга ингибиторов шаперона-кохаперона, имеющих высокую медицинскую значимость.
Вот основной принцип этого анализа. Когда взаимодействие между Hsp90C-концевым пептидом и доменом TPR кохаперонов приводит к сближению донорских и акцепторных шариков, генерируется сильно усиленный сигнал. Когда добавляются ингибиторы взаимодействия, донорские и акцепторные шарики не могут достичь близости, и не производится обнаруживаемый сигнал.
Начните с разбавления пептида Hsp90 в PBS в концентрации одного миллиграмма на миллилитр. Разбавьте неконъюгированные акцепторные шарики в PBS и переложите шарики в 1,5-миллилитровый тюбик. Центрифугируют разбавленные шарики для стирки, а затем аккуратно удаляют супернатант.
Для конъюгирования устанавливают акцепторные шарики в пептидах в соотношении 10 к 1. К шарикам палетида на PBS разбавляют пептид, Tween 20 и раствор цианаборогидрида натрия, и инкубируют с сквозным перемешиванием на ротационном шейкере. Чтобы заблокировать непрореагировавые участки, добавьте к шарикам 20 микролитров одного молярного раствора гидрохлорида Триса рН 8,0 и погасите реакцию путем инкубации в течение одного часа при 37 градусах Цельсия.
В конце инкубации промыть шарики центрифугированием и повторно суспендировать гранулу бусины в одном миллилитрах раствора гидрохлорида Триса. Повторите стирку еще два раза. После последней промывки повторно суспендировать шарики при концентрации в один миллиграмм на миллилитр в буфере для хранения и хранить сопряженный раствор акцептора при 4 градусах Цельсия, защищенный от света.
Добавьте донорские шарики глутатиона при концентрации 10 микрограммов на миллилитр в PBS. Добавьте GSTFKBP51 к конечной концентрации 10 мкг на миллилитр и инкубируют реакцию в течение 10 минут при 25 градусах Цельсия в темноте. Производят серийные разбавления исследуемого соединения в ДМСО.
Добавьте 0,25 микролитра искомого растворения соединения и утроение в углу каждой лунки плиты из 384 скважин. Для отрицательного контроля добавьте 0,25 микролитра DMSO, а для положительного контроля добавьте 0,25 микролитра пептида Hsp90 C-Terminal в скважины. Добавьте в каждую лунку 22,5 микролитра раствора, содержащего донорские шарики глутатиона с белками, помеченными GST.
Тщательно встряхните тарелку руками и высиживание в темноте при 25 градусах Цельсия в течение 15 минут. Разбавляют акцепторные шарики присоединенным пептидом Hsp90C-Terminal до 100 мкг на миллилитр концентрации в 0,5 раза PBS. Добавьте 2,25 микролитра разбавленных акцепторных шариков в каждую лунку.
Встряхните и высиживните пластину в темноте в течение 15 минут, как показано на демонстрации. Включите прибор считывателя пластин, измерьте сигнал пластины и проанализируйте данные, как описано в тексте рукописи. Создайте таблицу данных X-Y в диалоговом окне приветствия, выберите X numbers, Y и введите три повторяющихся значения в параллельные столбцы.
Импортируйте значения концентрации в столбец X, а значения сигнала в столбец Y. Нажмите кнопку «Анализировать», выберите «Преобразовать концентрацию X», а затем выберите «Преобразовать в логарифмы». Нажмите «Анализировать» и выберите нелинейную регрессию в разделе «Анализ X-Y».
Откройте опцию ингибирования реакции дозы и выберите уравнение наклона log и переменной реакции. Нажмите кнопку ОК, чтобы просмотреть результаты, содержащие значение IC50 и графики. Этот анализ использовался для скрининга малых молекул, ингибируя взаимодействия между Hsp90 и FKBP51 или FKBP52.
Оценка Z более 0,8 и отношение сигнал/фон 13,35 демонстрируют прочность и надежность для скрининга с высокой пропускной способностью. Оценивали влияние маломолекулярного тестового соединения D10 на ингибирование взаимодействий шаперон-кохаперон и рассчитывали значения IC50, где D10 показывал дозозависимое ингибирование. Значение IC50 для взаимодействий Hsp90 GSTFKBP51 составляло 65 наномоляров.
В то время как для взаимодействий Hsp90, GSTFKBP52 полное ингибирование не было достигнуто при самой высокой концентрации соединения, что указывает на то, что селективное ингибирование белково-белкового взаимодействия с малыми молекулами может быть достигнуто. Критическим шагом является порядок сложения. Сначала мы формируем комплекс между небольшой молекулой и ее мишенью TPR.
В противном случае требуется более длительная инкубация и более высокие концентрации соединений. Мы можем использовать этот метод для скрининга малых молекул, нарушающих взаимодействие между Hsp90 и FKB51 или Hsp90 и FKB52. Он также может быть распространен на любое взаимодействие между Hsp90, Hsp70 и мотивом TPR, содержащим селективные ингибиторы скрининга кохаперона.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается гомогенный анализ на основе микросфер для изучения взаимодействий между шаперонами и кошаперонами, в частности между Hsp90 и FKBP51 или FKBP52. Этот метод позволяет проводить высокопроизводительный скрининг малых молекул для поиска эффективных ингибиторов этих взаимодействий, которые имеют значение при различных заболеваниях человека.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биохимия
- Фармакология
Теоретическая база
- Hsp90 представляет собой белок-шаперон, участвующий в фолдинге других белков.
- FKBP51 и FKBP52 являются кошаперонами, которые взаимодействуют с Hsp90.
- Нарушение этих взаимодействий может иметь терапевтическое значение.
- Эти взаимодействия задействованы в развитии таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера, рак и аутоиммунные расстройства.
Цель исследования
- Разработка надежного метода анализа для скрининга ингибиторов взаимодействий Hsp90 с кошаперонами.
- Идентификация малых молекул, селективно нарушающих взаимодействия Hsp90-FKBP51 или Hsp90-FKBP52.
- Предоставление метода высокопроизводительного скрининга с минимальными требованиями к количеству образцов.
Используемые методы
- Гомогенный анализ на основе микросфер с использованием донорских микросфер, связанных с глутатионом.
- Кошапероны с TPR-мотивом, слитые с GST, и акцепторные микросферы с пептидами, производными от Hsp90.
- Высокопроизводительный скрининг малых молекул.
- Быстрое получение результатов в течение одного часа.
Основные результаты
- Идентификация мощных и селективных ингибиторов взаимодействий Hsp90-FKBP51.
- Демонстрация устойчивости и надежности метода анализа.
- Потенциал для скрининга соединений, имеющих высокую медицинскую значимость.
- Результаты обосновывают дальнейшее изучение возможностей терапевтического применения.
Выводы
- Разработанный метод анализа эффективен для изучения взаимодействий между шаперонами и кошаперонами.
- Он позволяет идентифицировать низкомолекулярные ингибиторы, имеющие потенциальное клиническое значение.
- Данная методика может способствовать развитию исследований в области терапии заболеваний, связанных с взаимодействиями Hsp90.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Таргетирование взаимодействий Hsp90 с кошаперонами позволяет селективно модулировать сигнальные пути, имеющие значение при различных заболеваниях, предлагая стратегию прецизионного терапевтического вмешательства при онкологических, нейродегенеративных и аутоиммунных расстройствах. Гомогенный анализ на основе микросфер представляет собой надежную масштабируемую платформу для валидации мишеней на ранних стадиях и идентификации лидерных соединений путем количественного определения нарушения белок-белковых взаимодействий в гомогенной среде. Это способствует снижению механистических рисков и повышению прогностической уверенности при приоритизации химических серий с селективными ингибирующими профилями в отношении Hsp90-FKBP51 или Hsp90-FKBP52.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать бинарные взаимодействия Hsp90-FKBP51 и Hsp90-FKBP52 для подтверждения связывания с мишенью и специфичности сигнального пути.
- Практическая ценность: требует минимального количества белка и соединения, что упрощает проведение скрининга на ранних стадиях при ограниченном наличии материалов.
- Прогностическая ценность: позволяет выявлять селективные ингибиторы (например, D10 с IC50 65 nM для FKBP51) для снижения риска побочных эффектов и повышения достоверности гипотезы относительно мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает количественные, однородные результаты (Z’ > 0,8, S/B = 13,35), подходящие для кампаний высокопроизводительного скрининга.
- Практическая ценность: Результаты получаются в течение одного часа, что позволяет быстро проводить итерации и своевременно принимать решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на этапе перехода от хита к лиду.
- Ценность воспроизводимости: Стандартизированные этапы конъюгации бусин и блокировки обеспечивают согласованность анализа между сериями опытов и различными лабораториями.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает скрининг соединений, нарушающих взаимодействия Hsp90 с кошаперонами, которые задействованы в развитии болезни Альцгеймера, рака и аутоиммунных заболеваний.
- Прогностическая ценность: Позволяет проводить раннюю оценку селективности мишени, помогая выбирать кандидатов с благоприятными механистическими профилями для дальнейших доклинических исследований.
- Ценность для непрерывности исследований: Результаты анализа (IC50, дозозависимый ответ) напрямую интегрируются в последующие рабочие процессы по оценке эффективности и безопасности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ соответствует этапу раннего поиска лекарственных средств, обеспечивая валидацию мишени посредством биохимического подтверждения нарушения взаимодействия Hsp90 с кошаперонами, и позволяя идентифицировать перспективные соединения с помощью высокопроизводительного скрининга библиотек малых молекул.
- Биология открытий: Подтверждает взаимодействие с мишенью путем измерения нарушения связей Hsp90-FKBP51 или Hsp90-FKBP52, что позволяет уточнить механизм действия.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа с устойчивым значением Z’-фактора и соотношением сигнал/фон, что гарантирует надежную оценку соединений в 384-луночном формате.
- Аналитика: Позволяет получать данные зависимости «доза-ответ» и значения IC50 с помощью нелинейной регрессии, что обеспечивает количественное сравнение эффективности и селективности ингибиторов.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты с системами, соответствующими конкретным заболеваниям, путем скрининга ингибиторов взаимодействий, связанных с патологиями человека, что способствует валидации мишеней с учетом биомаркеров.
- Корпоративное использование: Платформа может быть расширена на другие взаимодействия Hsp70/Hsp90-TPR кошаперонов, что увеличивает окупаемость инвестиций (ROI) для нескольких семей мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Механистическое снижение рисков за счет селективного ингибирования комплекса Hsp90-FKBP51 по сравнению с Hsp90-FKBP52, что уменьшает неопределенность в модуляции мишени.
- Операционная ценность: Низкий расход образцов (бисеров, белка, соединений) и короткое время получения результата (<1 hour) повышают эффективность скрининга.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать ранние решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на основе селективности к мишени, что повышает эффективность использования капитала и снижает риск неудач на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию химических серий с учетом рисков на основе подтвержденного взаимодействия с мишенью и профилей селективности.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области очистки белков (TPR-домены с GST-меткой) и химии конъюгации для анализов на основе микросфер.
- Необходимо наличие планшетного ридера с возможностью детектирования люминесценции и совместимостью с 384-луночными форматами.
- Требуется стандартизация соотношения конъюгации пептид-микросфера (10:1) и условий блокировки (1 M Tris, pH 8.0) для обеспечения воспроизводимости между партиями.
- Адаптация метода для альтернативных кошаперонов требует повторной валидации конъюгации с микросферами и кинетики взаимодействия.
- Практическое ограничение: на чувствительность анализа может повлиять автофлуоресценция соединений или гашение люминесценции, что потребует проведения ортогонального контрскрининга.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:28
Coupling of Hsp90 C-Terminal Peptide to the Acceptor Beads
2:49
Assay for Interaction Between GST-FKBP51 or GST-FKBP52 and Hsp90 C-Terminal Peptide and Inhibition with Small Molecular Mass Compounds
4:14
Dose-Response Curve Generation and IC50 Calculation
4:58
Results: Inhibitory Effect of Small Molecular Weight Test Compound D10
5:59
Conclusion
