Обнаружение чувствительных к нейтрализации эпитопов в антигенах, отображаемых на вакцинах на основе вирусоподобных частиц (VLP) с использованием анализа захвата
February 10th, 2022
Здесь мы представляем протокол для обнаружения эпитопов нейтрализации на антиген-дисплейных вирусоподобных частицах (VLP). Иммунопреципитация VLP, полученных из вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), выполняется с использованием гликопротеин-специфических моноклональных антител, связанных с белками G-конъюгированных магнитных шариков. Захваченные VLP впоследствии подвергаются SDS-PAGE и вестерн-блот-анализу с использованием вирусных основных белков, специфичных для Gag.
В моей лаборатории мы разрабатываем производственные системы для вирусных векторов и вирусоподобных частиц или вакцин на основе VLP. Анализ захвата VLP позволяет очень чувствительно обнаруживать целевые антигены, отображаемые на VLP. В этом анализе мы используем широко нейтрализующие антитела, направленные против эпитопов нейтрализации, чтобы доказать воздействие этих эпитопов на поверхность VLP.
Это важная оценка качества для вакцин-кандидатов, поскольку только VLP, демонстрирующие чувствительные к нейтрализации эпитопы, смогут вызвать нейтрализующий ответ антител у вакцин. Начните с приостановки магнитных шариков, либо пипеткой вверх и вниз, либо смешиванием на ротаторе при 50 оборотах в минуту в течение не менее пяти минут. Тем временем готовят раствор антител, содержащий bNABs.
Используйте 10 микрограммов каждого bNAB в 200 микролитрах буфера связывания антител и промывки на реакцию. Для каждой реакции переложите 50 микролитров раствора магнитного шарика в реакционную трубку объемом 1,5 миллилитра, затем поместите трубки на магнитную разделительную стойку. Подождите, пока бусины соберутся на трубчатом шаре, чтобы убедиться, что все бусины собраны, затем удалите супернатант.
Снимите магнит и подвешивайте шарики в 200 микролитрах предварительно приготовленного раствора bNAB. Инкубировать от 30 минут до трех часов, смешивая на ротаторе при 50 об/мин при комнатной температуре. После инкубации поместите реакционные трубки в стойку магнитного разделения, подождите и удалите супернатант.
Извлеките трубки из магнита и вымойте бусины, повторно подвешивая в 200 микролитрах буфер связывания антител и промывки. Повторите промывку с антителами, связывая и промывочный буфер, удаляя как можно больше промывочного буфера по завершении. Добавьте образцы в связанные с шариками bNAB.
Если добавленный объем образца составляет менее одного миллилитра, добавьте PBS, чтобы отрегулировать объем образца до одного миллилитра, а затем повторно приостановите шарики путем осторожного пипетирования. Инкубируйте образцы и бусины в течение 2,5 часов на ротаторе при комнатной температуре, следя за тем, чтобы шарики оставались в суспензии, а раствор тщательно перемешивался во время инкубации. Поместите трубки на магнит и удалите супернатант, затем промыть магнитные шарики, подвесив их в 200 микролитрах промывочного буфера.
Суспендировать шарики в 100 микролитрах промывочного буфера и перенести суспензию в чистую, термостойкую реакционную трубку. Поместите трубку на магнитную разделительную стойку и полностью удалите супернатант. Чтобы подготовить денатурированные образцы STS-PAGE, суспендируйте шарики в 20-80 микролитрах буфера Laemmli и инкубируйте при 95 градусах Цельсия в течение пяти минут.
Переходите непосредственно к SDS-PAGE, размещая трубки на магнитной стойке, чтобы отделить бусины от раствора. Кроме того, храните образцы при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Репрезентативный результат VLP, впервые захваченных из бесклеточной клеточной культуры супернатанта и гранул VLP с использованием bLAB, а затем подвергнутых анализу вестерн-блоттинга для обнаружения белков вирусного ядра, показан здесь.
Шарики, используемые для анализа захвата, были покрыты тремя различными bLAB, направленными против эпитопов нейтрализации гликопротеинов оболочки и антител изотипа, служащих отрицательным контролем. Используя шарики, покрытые изотопными антителами, белки Gag не были обнаружены в образцах VLP, содержащих лысые VLP, то есть Env-отрицательные VLP или ENV-дисплейные VLP, демонстрируя, что неспецифическое связывание VLP с шариками, покрытыми человеческими антителами, не опосредует захват VLP. Лысые VLP также не были связаны шариками, покрытыми bNAB, и, следовательно, никакие белки Gag не были обнаружены в анализе вестерн-блоттинга.
Напротив, все три bLAB захватывали VLP, отображающие Env-белки, поэтому белки Gag были легко обнаружены, демонстрируя наличие эпитопов нейтрализации в Env-гликопротеинах, отображаемых на VLP. Решающее значение для успеха анализа: тщательное смешивание VLP с шариками, покрытыми антителами. Лучше всего это достигается при использовании объемов более 500 микролитров при вращении.
В качестве альтернативы, захваченные VLP могут быть элюированы в условиях, не уменьшающихся. Это позволяет анализировать VLP с использованием иммуноэлектронной микроскопии или исследовать отображаемые антигены с использованием нативного PAGE.
Обзор
Эта статья представляет протокол для обнаружения нейтрализующих эпитопов на вирусоподобных частицах (ВЧП) с использованием анализа захвата. Метод использует широко нейтрализующие антитела (бНАТ) для оценки экспозиции этих эпитопов, что важно для оценки кандидатских вакцин.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Разработка вакцин
- Вирусология
Предыстория
- Вирусоподобные частицы (ВЧП) важны для разработки вакцин.
- Нейтрализующие эпитопе являются критичными для вызывания иммунного ответа.
- Широко нейтрализующие антитела могут быть использованы для обнаружения этих эпитопов.
- Оценка качества ВЧП является важной для эффективных кандидатских вакцин.
Цель исследования
- Разработать чувствительный анализ для обнаружения нейтрализующих эпитопов на ВЧП.
- Демонстрировать важность этих эпитопов в эффективности вакцины.
- Предоставить детальный протокол для исследователей в этой области.
Используемые методы
- Иммунопреципитация ВЧП, полученных от ВИЧ, с использованием бНАТ.
- Использование магнитных перлитов, связанных с белком G, для захвата ВЧП.
- SDS-PAGE и анализ Western blot для обнаружения вирусных белков ядра.
- Тщательное смешивание ВЧП с перлитью, покрытыми антителами, для эффективного захвата.
Основные результаты
- ВЧП, демонстрирующие белки Env, были успешно захвачены с использованием бНАТ.
- Белки Gag не были обнаружены в Env-отрицательных ВЧП, что подтверждает специфичность.
- Все три бНАТ продемонстрировали эффективную связь с нейтрализующими-чувствительными ВЧП.
- Успех анализа зависит от правильных условий смешивания и инкубации.
Выводы
- Анализ предоставляет надежный метод для оценки качества ВЧП.
- Нейтрализующие эпитопе необходимы для индукции иммунного ответа.
- Этот протокол может помочь в разработке эффективных вакцин.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
The VLP capture assay provides a sensitive method to evaluate vaccine candidate quality by confirming the presence of neutralization-sensitive epitopes on antigen-displaying virus-like particles. This enables early prediction of neutralizing B-cell response potential, supporting go/no-go decisions in vaccine development pipelines. The assay reduces biological risk by validating structural integrity of envelope glycoproteins prior to costly preclinical and clinical advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Confirms exposure of neutralization-sensitive epitopes on VLP surfaces, enabling therapeutic hypothesis interrogation of vaccine immunogenicity.
- Operational Value: Uses broadly neutralizing antibodies as functional probes to de-risk target validation through epitope-specific binding evidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Enables preparation of antigen-displaying VLPs for downstream immunoassays by isolating particles with preserved structural integrity.
- Operational Value: Delivers quantitative detection of viral core proteins (e.g., Gag) via Western blot, supporting assay standardization and reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates continuity from VLP production to immune relevance by linking epitope exposure to predicted neutralizing antibody responses in humans.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by identifying VLPs capable of eliciting protective immunity before animal challenge studies.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery-to-preclinical continuum, positioning post-production VLP characterization before immunogenicity testing to inform lead candidate selection.
- Discovery Biology: Validates that VLPs display cognate antigens in native conformation, supporting biological de-risking of vaccine constructs.
- Screening: Confirms assay readiness through specific capture of Env-positive VLPs and absence of signal in Env-negative controls.
- Analytics: Generates Western blot readouts of Gag proteins as a quantitative proxy for captured VLP yield and integrity.
- Translational Research: Connects biophysical VLP quality to immunological predictive value by confirming exposure of neutralization-sensitive epitopes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable QC platform for VLP-based vaccine candidates across multiple antigen targets and serotypes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in vaccine efficacy through direct assessment of neutralizing epitope exposure.
- Operational Value: Standardized capture and wash steps using magnetic beads ensure reproducibility across laboratories and production batches.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by filtering VLPs lacking functional epitopes, reducing late-stage biological failure risk.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of VLP candidates based on structural and functional quality metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoprecipitation, antibody handling, and magnetic bead-based separation techniques.
- Depends on access to protein A/G-conjugated magnetic beads, broadly neutralizing antibodies, and Western blot instrumentation.
- Necessitates standardization of bead-VLP mixing volumes (>500 µL) and rotation conditions to ensure efficient capture.
- Involves adaptation considerations for non-HIV VLPs, including antibody selection and buffer optimization for different antigen targets.
- Includes practical limitations such as the need for high-titer bNAbs and potential steric hindrance in densely packed VLP arrays.
