Молекулярные и иммунологические методы в генетически модифицированной мышиной модели стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта
2 мая 2022 г.
Целью данной рукописи является описание мышиной модели KitV558Δ/+ и методов успешного вскрытия и обработки образцов мышей.
Наш протокол описывает разведение, поддержание, рассечение и обработку образцов единственной иммунокомпетентной мышиной модели, GIST, используемой в настоящее время. Мы надеемся, что будущие исследователи смогут использовать эту модель мыши для дальнейших трансляционных исследований в GIST. Традиционная терапия в GIST включает таргетную молекулярную терапию ингибиторами тирозинкиназы.
Эта модель позволяет исследователям тестировать иммунотерапию в GIST. Для начала стерилизуйте все инструменты, носите перчатки на протяжении всей процедуры и поддерживайте стерильное поле. Подготовьте участок разреза с 70% этанолом.
С помощью ножниц сделайте двухсантиметровый вертикальный разрез средней линии и войдите в брюшную полость. Резко лизируют любые внутрибрюшные спайки. Чтобы удалить дренирующий брыжеечный лимфатический узел, определите слепую кишку и поднимите ее брыжейку лучше.
Примерно на полпути к основанию брыжейки толстой кишки определите брыжеечный лимфатический узел и резко рассекните его. По мере необходимости разделите ткань лимфатического узла на трети для выделения белка, гистологии и одноклеточной суспензии. Поместите ткань лимфатических узлов в 20 миллилитров среды RPMI для одноклеточных суспензий и держите на льду.
Слепая кость в основном заменяется GIST у мышей Kit558. Для выделения ГИСТ и слепой кишки осторожно отделите илеоколическое соединение от основания опухоли. Затем снова разделите слепую кишку, на два сантиметра дистальнее основания опухоли.
У 50-60% мышей Kit558 головка опухоли содержит колпачок ткани слепой кишки, который обычно содержит серозную жидкость, но редко может содержать гной. Резко рассекните ткань колпачка от опухолевой ткани. Разделите опухолевую ткань и слепую кишку на трети для выделения белка, гистологии и одноклеточной суспензии.
Для одноклеточных суспензий поместите опухолевую ткань или слепую кишку в HBSS с 2% FCS, достаточным для покрытия образца, и держите на льду. Вылейте RPMI-среду с образцом лимфатического узла на 100-микрометровый фильтр. Переместите фильтр на новый 50-миллилитровый конический, и разомните лимфатический узел мягким концом трехмиллилитрового пластикового шприца.
Промывочный фильтр с 20 миллилитрами rpmi среды. Центрифугируйте образцы и аспирируйте супернатант. Повторно суспендировать гранулу в 20 миллилитрах шарикового буфера и перелить на 40-микрометровый фильтр.
Соберите фильтрат клеток. Подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра. Центрифугируйте образцы и выбросьте супернатант.
Затем повторно суспендировать в бусинчатом буфере для проточной цитометрии. Подготовьте буфер коллагеназы, как описано в тексте рукописи. Поместите GIST в стерильную посуду и добавьте 2,5 миллилитра коллагеназного буфера.
Используя стерильный скальпель и ножницы, измельчите опухоль до тех пор, пока она не окажется в мелких фрагментах. Используйте пипетку с большим отверстием, чтобы аспирировать опухоль и коллагеназу в 50-миллилитровую трубку. Инкубируют его при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут со скоростью 100 оборотов в минуту, затем гасят реакцию двумя миллилитрами FBS.
Налейте коллагеназу с образцом GIST на 100-микрометровый фильтр и разомните опухоль мягким концом трехмиллилитрового пластикового шприца и соберите в 50-миллилитровую трубку. Фильтр для промывки с 20 миллилитрами HBSS. Центрифугируйте фильтрат при 450 RCF в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, затем выбросьте супернатант.
Повторно суспендировать гранулу в 20 миллилитрах шарикового буфера и перелить на 40-микрометровый фильтр Соберите фильтрат и подсчитайте ячейки с помощью гемоцитометра. Центрифугируют и аспирируют супернатант, затем повторно суспендируют в шариковый буфер для проточной цитометрии. С помощью ножниц расщелите слепую кишку продольно, чтобы обнажить внутреннюю слизистую оболочку.
Разрежьте его на 0,5-сантиметровые срезы и поместите в 50-миллилитровую трубку с пятью миллилитрами HBSS и 2% FBS. Энергично встряхните в течение 30 секунд и центрифугируйте при 450 RCF в течение 20 секунд. Затем отбросьте супернатант.
Добавьте от пяти до 20 миллилитров HBSS с двухмиллимолярной ЭДТА. Инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия при 100 оборотах в минуту в течение 15 минут. Центрифугируйте и выбросьте супернатант, затем повторно суспендируйте гранулу в пяти-20 миллилитрах HBSS.
Энергично встряхните смесь в течение 30 секунд, затем центрифугируйте при 450 RCF в течение 20 секунд и выбросьте супернатант. Повторите этот процесс еще раз. Повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах коллагеназного буфера, затем инкубируйте ее при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут со скоростью 100 оборотов в минуту.
Энергично встряхивайте каждые 10 минут и гасите реакцию двумя миллилитрами FBS. Налейте коллагеназу с образцом слепой кишки на 100-микрометровый фильтр и разомните мягким концом трехмиллилитрового пластикового шприца. Промыть фильтр 20 миллилитрами HBSS и собрать фильтрат.
Центрифугируйте и выбросьте супернатант. Повторно суспендировать гранулу в 20 миллилитрах шарикового буфера и перелить на 40-микрометровый фильтр. Соберите фильтрат и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
Повторите процесс центрифугирования еще раз и повторно суспендируйте гранулу в шариковом буфере для проточной цитометрии. Мыши Kit558 имели среднюю продолжительность жизни восемь месяцев из-за прогрессирующей непроходимости кишечника. Опухоли у мышей Kit558 экспрессировали канонические маркеры GIST, включая тирозинкиназу KIT, трансмембранный канал Dog1 и транскрипционный фактор ETV1.
Опухоли были изучены на предмет изменений в сигнальном пути KIT, таких как нисходящие маркеры ERK и AKT или иммунная микросреда, которая близко имитировала GIST человека. МРТ или КТ использовались для отслеживания объема опухоли в качестве точного измерения ответа опухоли. Рассечение опухоли от илеоколического соединения и от цекальной шапки важно для захвата истинного веса опухоли и иммунного и молекулярного анализа.
В рамках GIST эта модель позволила исследовать микроокружение опухоли, а также иммунотерапию.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной рукописи описывается модель мыши Kit V558Δ/+ и излагаются методы успешного препарирования и обработки образцов мышей. Данный протокол предназначен для содействия трансляционным исследованиям гастроинтестинальных стромальных опухолей (GIST) с использованием этой иммунокомпетентной модели.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биология
- Трансляционные исследования
Теоретические основы
- Мышиная модель Kit V558Δ/+ на данный момент является единственной иммунокомпетентной моделью GIST.
- Традиционная терапия GIST включает таргетную молекулярную терапию.
- Данная модель позволяет проводить тестирование методов иммунотерапии.
- Правильное вскрытие и обработка образцов имеют решающее значение для точности исследований.
Цель исследования
- Описать разведение и содержание мышиной модели Kit V558Δ/+.
- Представить детальный протокол диссекции и обработки образцов.
- Углубить понимание GIST и усовершенствовать методологии исследований.
Используемые методы
- Разведение и содержание мышиной модели Kit V558Δ/+.
- Стерилизация инструментов и поддержание стерильности рабочей зоны.
- Подготовка мест разреза 70% этанолом.
- Методы детального диссекции и обработки образцов.
Основные результаты
- Данный протокол обеспечивает успешное препарирование и обработку образцов.
- Способствует использованию модели Kit V558Δ/+ в будущих исследованиях.
- Создает основу для тестирования методов иммунотерапии при GIST.
Выводы
- Мышиная модель Kit V558Δ/+ является ценным инструментом для исследования GIST.
- Применение правильных методов диссекции и обработки имеет решающее значение для получения достоверных результатов.
- Данное исследование направлено на поддержку будущих трансляционных исследований GIST.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Генетически модифицированная модель мыши KitV558Δ/+ представляет собой иммунокомпетентную, релевантную заболеванию систему для трансляционных исследований гастроинтестинальных стромальных опухолей (GIST). Данная модель позволяет проводить строгую оценку как таргетной молекулярной, так и иммунной терапии, устраняя ограничения моделей ксенографтов и повышая прогностическую достоверность доклинических исследований в онкологии. Соответствие данной модели гистологии и иммунному микроокружению GIST человека способствует снижению механистических рисков и помогает в принятии решений по развитию портфеля препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Позволяет исследовать онкогенные пути, управляемые KIT, в физиологически релевантном контексте.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем воспроизведения гистологии и иммунного инфильтрата ГИСТ человека.
- Способствует механистическому снижению рисков как для молекулярных, так и для иммунологических терапевтических гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение валидированных опухолевых и лимфоидных тканей для последующего проведения молекулярного и иммунологического анализа.
- Позволяет воспроизводимо подготавливать суспензии одиночных клеток для проточной цитометрии и количественного анализа.
- Обеспечивает стандартизацию и масштабируемость анализа для скрининга соединений и методов иммунотерапии.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет доклинические данные с биологией заболеваний человека, повышая значимость трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает возможность лонгитюдной визуализации и количественной оценки ответа опухоли с помощью МРТ или КТ.
- Поддерживает обоснованное с учетом рисков внедрение иммунотерапии и таргетных препаратов при GIST.
Интеграция в конвейеры и рабочие процессы
Эта модель связывает этапы раннего поиска, идентификации соединений-лидеров и доклинической валидации для GIST, обеспечивая надежную проверку гипотез и трансляционную преемственность.
- Открытия в биологии: способствует уточнению сигнальных путей и анализу иммунного микроокружения при GIST с мутацией KIT.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты для молекулярных и иммунологических анализов.
- Аналитика: позволяет измерять объем опухоли, популяции иммунных клеток и маркеры активации сигнальных путей.
- Трансляционные исследования: предоставляет платформу для согласования биомаркеров и изучения доклинической эффективности.
- Корпоративное повторное использование: создает воспроизводимую иммунокомпетентную модель для текущих исследований GIST и оценки терапевтического воздействия.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях GIST.
- Операционная ценность: Стандартизирует обработку образцов и рабочие процессы анализа для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: Помогает в принятии решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и снижает биологические риски на поздних этапах в онкологических портфелях.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение новых методов терапии GIST.
Особенности реализации
- Требуется опыт в разведении и содержании генетически модифицированных моделей мышей.
- Необходим доступ к стерильному хирургическому инструментарию и современным методам визуализации.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов обработки тканей и анализа.
- Может потребоваться адаптация для интеграции с различными платформами молекулярного и иммунологического анализа.
- При планировании эксперимента необходимо учитывать продолжительность жизни модели и скорость прогрессирования опухоли.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
KitV558Δ/+ Mouse Organ Harvest
2:26
Single-Cell Suspension of Mesenteric Lymph Node
3:09
Single-Cell Suspension of GIST
4:22
Single-Cell Suspension of Cecum
6:06
Results: Investigation of Therapeutics in an Immunocompetent Mouse Model
6:49
Conclusion
