Молекулярные и иммунологические методы в генетически модифицированной мышиной модели стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта

Наш протокол описывает разведение, поддержание, рассечение и обработку образцов единственной иммунокомпетентной мышиной модели, GIST, используемой в настоящее время. Мы надеемся, что будущие исследователи смогут использовать эту модель мыши для дальнейших трансляционных исследований в GIST. Традиционная терапия в GIST включает таргетную молекулярную терапию ингибиторами тирозинкиназы.

Эта модель позволяет исследователям тестировать иммунотерапию в GIST. Для начала стерилизуйте все инструменты, носите перчатки на протяжении всей процедуры и поддерживайте стерильное поле. Подготовьте участок разреза с 70% этанолом.

С помощью ножниц сделайте двухсантиметровый вертикальный разрез средней линии и войдите в брюшную полость. Резко лизируют любые внутрибрюшные спайки. Чтобы удалить дренирующий брыжеечный лимфатический узел, определите слепую кишку и поднимите ее брыжейку лучше.

Примерно на полпути к основанию брыжейки толстой кишки определите брыжеечный лимфатический узел и резко рассекните его. По мере необходимости разделите ткань лимфатического узла на трети для выделения белка, гистологии и одноклеточной суспензии. Поместите ткань лимфатических узлов в 20 миллилитров среды RPMI для одноклеточных суспензий и держите на льду.

Слепая кость в основном заменяется GIST у мышей Kit558. Для выделения ГИСТ и слепой кишки осторожно отделите илеоколическое соединение от основания опухоли. Затем снова разделите слепую кишку, на два сантиметра дистальнее основания опухоли.

У 50-60% мышей Kit558 головка опухоли содержит колпачок ткани слепой кишки, который обычно содержит серозную жидкость, но редко может содержать гной. Резко рассекните ткань колпачка от опухолевой ткани. Разделите опухолевую ткань и слепую кишку на трети для выделения белка, гистологии и одноклеточной суспензии.

Для одноклеточных суспензий поместите опухолевую ткань или слепую кишку в HBSS с 2% FCS, достаточным для покрытия образца, и держите на льду. Вылейте RPMI-среду с образцом лимфатического узла на 100-микрометровый фильтр. Переместите фильтр на новый 50-миллилитровый конический, и разомните лимфатический узел мягким концом трехмиллилитрового пластикового шприца.

Промывочный фильтр с 20 миллилитрами rpmi среды. Центрифугируйте образцы и аспирируйте супернатант. Повторно суспендировать гранулу в 20 миллилитрах шарикового буфера и перелить на 40-микрометровый фильтр.

Соберите фильтрат клеток. Подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра. Центрифугируйте образцы и выбросьте супернатант.

Затем повторно суспендировать в бусинчатом буфере для проточной цитометрии. Подготовьте буфер коллагеназы, как описано в тексте рукописи. Поместите GIST в стерильную посуду и добавьте 2,5 миллилитра коллагеназного буфера.

Используя стерильный скальпель и ножницы, измельчите опухоль до тех пор, пока она не окажется в мелких фрагментах. Используйте пипетку с большим отверстием, чтобы аспирировать опухоль и коллагеназу в 50-миллилитровую трубку. Инкубируют его при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут со скоростью 100 оборотов в минуту, затем гасят реакцию двумя миллилитрами FBS.

Налейте коллагеназу с образцом GIST на 100-микрометровый фильтр и разомните опухоль мягким концом трехмиллилитрового пластикового шприца и соберите в 50-миллилитровую трубку. Фильтр для промывки с 20 миллилитрами HBSS. Центрифугируйте фильтрат при 450 RCF в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, затем выбросьте супернатант.

Повторно суспендировать гранулу в 20 миллилитрах шарикового буфера и перелить на 40-микрометровый фильтр Соберите фильтрат и подсчитайте ячейки с помощью гемоцитометра. Центрифугируют и аспирируют супернатант, затем повторно суспендируют в шариковый буфер для проточной цитометрии. С помощью ножниц расщелите слепую кишку продольно, чтобы обнажить внутреннюю слизистую оболочку.

Разрежьте его на 0,5-сантиметровые срезы и поместите в 50-миллилитровую трубку с пятью миллилитрами HBSS и 2% FBS. Энергично встряхните в течение 30 секунд и центрифугируйте при 450 RCF в течение 20 секунд. Затем отбросьте супернатант.

Добавьте от пяти до 20 миллилитров HBSS с двухмиллимолярной ЭДТА. Инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия при 100 оборотах в минуту в течение 15 минут. Центрифугируйте и выбросьте супернатант, затем повторно суспендируйте гранулу в пяти-20 миллилитрах HBSS.

Энергично встряхните смесь в течение 30 секунд, затем центрифугируйте при 450 RCF в течение 20 секунд и выбросьте супернатант. Повторите этот процесс еще раз. Повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах коллагеназного буфера, затем инкубируйте ее при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут со скоростью 100 оборотов в минуту.

Энергично встряхивайте каждые 10 минут и гасите реакцию двумя миллилитрами FBS. Налейте коллагеназу с образцом слепой кишки на 100-микрометровый фильтр и разомните мягким концом трехмиллилитрового пластикового шприца. Промыть фильтр 20 миллилитрами HBSS и собрать фильтрат.

Центрифугируйте и выбросьте супернатант. Повторно суспендировать гранулу в 20 миллилитрах шарикового буфера и перелить на 40-микрометровый фильтр. Соберите фильтрат и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.

Повторите процесс центрифугирования еще раз и повторно суспендируйте гранулу в шариковом буфере для проточной цитометрии. Мыши Kit558 имели среднюю продолжительность жизни восемь месяцев из-за прогрессирующей непроходимости кишечника. Опухоли у мышей Kit558 экспрессировали канонические маркеры GIST, включая тирозинкиназу KIT, трансмембранный канал Dog1 и транскрипционный фактор ETV1.

Опухоли были изучены на предмет изменений в сигнальном пути KIT, таких как нисходящие маркеры ERK и AKT или иммунная микросреда, которая близко имитировала GIST человека. МРТ или КТ использовались для отслеживания объема опухоли в качестве точного измерения ответа опухоли. Рассечение опухоли от илеоколического соединения и от цекальной шапки важно для захвата истинного веса опухоли и иммунного и молекулярного анализа.

В рамках GIST эта модель позволила исследовать микроокружение опухоли, а также иммунотерапию.