Отслеживание динамики структурных вариантов в экспериментально эволюционировавших популяциях
February 3rd, 2023
Мы разработали экономически эффективный метод отслеживания динамики аллелей неоднонуклеотидного полиморфизма, который может быть легко адаптирован к экспериментальным эволюционным замороженным архивам. Метод триплетной ПЦР сочетался с автоматическим параллельным капиллярным электрофорезом для количественной оценки относительной частоты аллеля вставки в ходе экспериментальной эволюции.
Структурные варианты, такие как вставки, делеции, дублирования и инверсии, в прошлом было труднее отслеживать экспериментально, и их частоты не могут быть точно измерены с помощью секвенирования ампликонов. Здесь мы предлагаем простой экономически эффективный метод, который объединяет тройной дизайн праймера и параллельный капиллярный электроферез для отслеживания частот аллелей структурных вариантов с течением времени. Этот метод был разработан, чтобы дополнить секвенирование конечных точек в экспериментальной эволюции и проследить частоты возникающих аллелей de novo.
Мы надеемся, что этот метод также принесет пользу тем, кто работает с данными о патогенах внутри хозяев. Демонстрировать процедуру будет Жанна Хамет, научный сотрудник нашей лаборатории. Различные этапы методов будут показаны в случае, когда производный аллель является результатом вставки IS10 в бактериальный ген, называемый mutS.
Во-первых, разработайте пару праймеров для амплификации короткого ампликона на аллеле дикого типа вокруг места вставки мутантов. Разработайте третий праймер вперед праймер два в последовательности вставки, чтобы получить небольшую переменную размера из ампликона дикого типа. Начните с извлечения ДНК из 24-часовых культур фиксированного дикого типа и мутантных аллельных клонов.
После количественного определения ДНК разбавьте каждый экстракт ДНК до пяти нанограммов на микролитр водой. Зафиксируйте два образца в соотношении 50/50. Настройте реакцию объемом 20 микролитров, содержащую 10 нанограммов образца ДНК, праймеров и мастер-смеси для ПЦР.
Затем отделяют продукт ПЦР с помощью электрофореза, используя 2%-ный агарозный гель. Разница в размерах между ампликонами дикого типа и мутанта должна быть проверена на геле. Чтобы получить калибровочную кривую, начните со смешивания ДНК дикого типа и мутантной ДНК в различных соотношениях.
Разбавьте продукты ПЦР до 0,1 нанограмма на микролитр концентрации. Чтобы приготовить разделительный гель, смешайте свежий гель и краситель. Замените входной буфер.
Поместите буфер для полоскания в правильное место ящика прибора для параллельного капиллярного электрофореза. Добавьте 22 микролитра маркера разбавителя в лунки 96-луночной пластины. Теперь добавьте два микролитра разбавленных продуктов ПЦР в каждую лунку образца.
К одному Ну, добавьте лестницу размера ДНК из высокочувствительного набора, размером от одной до 6 000 пар оснований. Поместите микропланшет в прибор для параллельного капиллярного электрофореза в выбранном прогоне программного обеспечения прибора. Проанализируйте результаты с помощью программного обеспечения для анализа данных.
Во-первых, определите пики на основе их известного размера. Количественно оцените каждый ампликон, чтобы получить калибровочную кривую. Наконец, убедитесь, что относительные количества двух аллелей измерены правильно.
Эта калибровочная кривая затем используется для расчета количества структурных вариантов после амплификации ПЦР и параллельного капиллярного электрофореза. Эти репрезентативные результаты следуют за разрушительной вставкой в ген mutS. Нокдауны и mutS приводят к фенотипу гипермутатора, позволяя бактериям отбирать больше мутаций, чем их базовая частота мутаций.
С помощью представленного метода отслеживалась частота структурных вариантов mutS на протяжении 1000 поколений. Выявлена немонотонная траектория формирующегося мутантного аллеля. Мутантный аллель был впервые обнаружен в поколении 680.
Затем аллель быстро увеличился в частоте, достигнув 67% к поколению 713. Затем это увеличение застопорилось, увеличившись всего на 10% в течение следующих 53 поколений, до 76%Неожиданно частота мутантных аллелей затем снизилась с 76% до 49% в течение 13 поколений, после чего она увеличилась до фиксации. Этот метод принесет пользу тем, кто работает над экспериментальной эволюцией.
Этот протокол позволяет пользователю брать замороженные архивы и исследовать эволюционные траектории, которые в противном случае невозможно наблюдать с помощью данных секвенирования конечных точек.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Это исследование представляет новый экономичный метод для отслеживания динамики структурных вариантных аллелей, в частности, вставок, в процессе экспериментальной эволюции. Сочетая разработку тройных праймеров с параллельной капиллярной электрофорезой, методика может показать изменения частоты аллелей со временем, демонстрируя ее полезность в изучении эволюционных траекторий.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Генетика
- Экспериментальная эволюция
- Структурные варианты
Предпосылки
- Количественное определение структурных вариантов было сложно с помощью конвенциональных методов.
- Усиление и измерение частоты вставочных аллелей важно для понимания их роли в эволюции.
- Метод нацелен на дополнение существующих методов секвенирования.
Использованные методы
- Тройная ПЦР-техника в сочетании с автоматизированной параллельной капиллярной электрофорезой
- Бактериальная модельная система (ген mutS)
- Количественная оценка частоты аллелей
Основные результаты
- Успешное отслеживание немонотонной траектории аллеля mutS в течение 1000 поколений.
- Выявлены сложные динамические процессы, где частота мутации сначала возросла, затем снизилась до фиксации.
- Продемонстрировано применение анализа замороженных фиксированных образцов для эволюционных исследований.
Выводы
- Исследование представляет надежный метод наблюдения за динамикой структурных вариантов, которые иначе остаются незамеченными при конечном секвенировании.
- Этот подход представляет значительные возможности для исследователей, изучающих экспериментальную эволюцию и динамику патогенов.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Quantifying structural variant (SV) allele dynamics is critical for understanding genetic adaptation and phenotypic diversity in microbial and pathogen populations. This method enables precise, cost-effective tracking of SV frequencies, addressing a key gap in discovery-stage genomics and supporting predictive confidence in variant-driven functional studies. Its scalability and compatibility with pooled samples position it as a valuable tool for early discovery and translational research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative tracking of SV allele frequencies to clarify variant-driven phenotypes.
- Supports functional target validation by monitoring de novo allele emergence in evolving populations.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing non-monotonic variant trajectories over time.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for downstream screening by quantifying SVs in pooled samples.
- Standardizes SV detection with reproducible primer design and capillary electrophoresis readouts.
- Enables scalable, parallelized analysis suitable for high-throughput variant screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by enabling SV quantification in intra-host pathogen populations.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by tracking variant dynamics in archived samples.
- Provides predictive value for risk-adjusted advancement decisions in microbial and pathogen research.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling dynamic SV tracking from early hypothesis testing through translational research, especially in microbial and pathogen systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying emerging SVs.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative SV measurements for assay readiness.
- Analytics: Provides calibration-based quantification and comparative analysis of allele frequencies.
- Translational Research: Enables SV tracking in natural and intra-host populations, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, cost-effective workflow for SV quantification across diverse projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in SV-driven studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible SV quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying variant impact early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of SV-related targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primer design and capillary electrophoresis instrumentation.
- Needs access to parallel capillary electrophoresis and quantitative analysis software.
- Demands cross-team standardization of calibration and normalization protocols.
- Adaptable to various SV types and pooled sample contexts with appropriate primer sets.
- Limited by requirement for detectable amplicon size differences and calibration accuracy.
