Оптимизированный рабочий процесс для итеративного отбеливания расширяет возможности мультиплексной визуализации высокоавтофлуоресцентных клинических образцов

[Рассказчик] С помощью пространственной протеомики, названной «Методом года 2024» по версии Nature Methods, можно составить карту точного расположения иммунных клеток, а также межклеточных взаимодействий в тканях. Это выявляет пространственные закономерности, связанные с клиническими исходами. Создание сложных панелей антител и визуализация тканей с высокой эндогенной флуоресценцией представляют собой значительные проблемы с точки зрения времени, ресурсов и опыта для IBEX и других методов флуоресцентной микроскопии. С помощью IBEX были выявлены опухолеспецифичные особенности у пациентов с фолликулярной лимфомой высокого риска, а также у коллег из Human Cell Atlas. Была создана комплексная пространственная карта тимуса человека. Мало что известно о составе иммунных клеток, пространственных взаимодействиях и различиях в продукции цитокинов при различных микобактериальных легочных патологиях. Этот протокол устраняет этот пробел. Этот протокол предлагает недорогой, адаптируемый метод фотооблучения, позволяющий значительно снизить аутофлуоресценцию тканей широкого спектра действия, особенно в сложных образцах FFPE, сохраняя при этом сигнал антител для пространственного анализа. Для начала погрузите предметные стекла с тканью в PBS после завершения забора антигена. Снимите одно предметное стекло с PBS и используйте безворсовую салфетку, чтобы тщательно вытереть все излишки буфера, не касаясь ткани. С помощью гидрофобной ручки нарисуйте границу вокруг участка ткани на предметном стекле. Повторив процесс для оставшихся горок, дайте гидрофобным барьерам высохнуть в течение 10 минут. Затем с помощью безворсовой салфетки отведите PBS от участка ткани, не касаясь ткани напрямую. Теперь добавьте 200 микролитров блокирующего буфера на предметное стекло и закройте камеру с влажностью. Поместите камеру в ненагреваемую научную микроволновую печь с механизмом регулировки температуры и запустите ранее установленную программу в течение пяти циклов. Во время инкубации блокирующих антител готовят первичный окрашивающий антитела раствор 1 с крючками и блокирующим буфером, содержащим Fc-блок. Соедините антитела и аккуратно перемешайте коктейль. Когда цикл микроволновой печи завершится, снимите и откройте камеру предметного стекла и снимите блокирующий буфер со предметного стекла, не касаясь ткани. Далее добавьте на предметное стекло 200 микролитров первичного раствора для окрашивания антител 1. Верните камеру в микроволновую печь и снова выполните программу первичного антитела в течение примерно 30 минут. После того, как мечение первичных антител будет завершено, держите предметное стекло вертикально. Чтобы промыть предметное стекло, нанесите пипетку 1000 микролитров PBS на салфетку, позволяя ей стечь. Откачайте излишки PBS и зафиксируйте предметное стекло 1% параформальдегидом на 10 минут при комнатной температуре в камере влажности. После фиксации тщательно промойте предметное стекло 1000 микролитрами PBS три-пять раз и оставьте слой PBS на ткани до этапа фотооблучения. Чтобы подготовить бокс для фотооблучения, соберите 150-ваттную светодиодную лампу, 40-ваттную RGBW-светодиодную лампу, большую пластиковую емкость емкостью 75,71 литра и более, свежую PBS и чашку Петри. Теперь заполните чашку Петри 1x PBS, чтобы полностью погрузить предметное стекло. Проводите процедуру фотооблучения в холодном помещении, чтобы свести к минимуму тепло от ламп. Затем поместите предметное стекло в чашку Петри, убедившись, что она полностью погружена в PBS. Затем поместите 40-ваттную лампу прямо над чашкой Петри источником света вниз к горке и установите лампу в режим красного света. Наконец, включите лампы мощностью 150 Вт и 40 Вт и накройте всю установку пластиковой крышкой контейнера. Через два часа переключите лампу на зеленый свет и выиграйте в течение 16 часов. Были идентифицированы самые яркие флуорофоры, совместимые с протоколом инактивации красителя, и сопряжены с низко экспрессированными маркерами для улучшения детектирования сигнала. Автофлуоресценция была значительно снижена после фотооблучения и при более длинных волнах изображения. Непосредственно конъюгированные антитела, нацеленные на высокоэкспрессированные структурные маркеры, альфа-гладкомышечный актин и панцитокератин, замещены в ближнем инфракрасном канале на 750 нанометрах. Фоновый сигнал был вычтен вычислительно с использованием неокрашенного эталонного изображения и арифметики SimpleITK, а истинные сигналы были усилены за счет порогового значения. При визуализации всего предметного стекла окрашенных IBEX срезов были выявлены гранулемы с некротическими ядрами и CD15-положительными нейтрофилами. Микобактерии туберкулеза или нетуберкулезные микобактерии были обнаружены вблизи некротического ядра гранулемы с использованием антитела к антигену 85В. Лимфоидная ткань, ассоциированная с гранулемой, содержала CD20-положительные В-клетки, CD4-положительные Т-клетки, несколько CD8-положительных Т-клеток и CD45-мечение всех иммунных клеток в легких. Визуализация IBEX также позволила визуализировать анатомические особенности легких, включая эпителиальные клетки бронхов, гладкую мускулатуру артерий и CD68-положительные макрофаги.