Валидированный иммунохимический анализ для комплексного определения рецептора 2 эпидермального фактора роста человека, высвобождаемого из клеток и связанного с ними

Мы представляем валидированный сэндвич ИФА с использованием новых моноклональных антител, который позволяет точно количественно определить связанный с клетками и высвобожденный внеклеточный домен белка HER2 для культивируемых in vitro клеток и образцов пациентов.

Протокол учитывает потребность в точном и валидированном анализе для корреляции концентрации циркулирующего белка HER2 с клиническими проявлениями заболевания в диагностике и исследованиях.

Широкий рабочий диапазон анализа, разнообразие типов образцов и достоверность результатов могут открыть новые возможности для всестороннего анализа рецепторного статуса в моделях in vitro и in vivo.

Разработанный ИФА будет использоваться для количественного определения HER2, высвобождаемого из раковых тканей в различные экскреции организма человека, такие как кровь, перитонеальные жидкости или слизь.

[Инструктор] Для начала отделите клетки с помощью трипсина после того, как они достигнут 80% слияния, и соберите их в отдельную коническую трубку объемом 15 миллилитров. После подсчета клеток с помощью автоматического счетчика клеток засейте трижды по 10 в степени пяти клеток на лунку в 12-луночный планшет с одним миллилитром питательной среды. Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Из 24-часовой культуры соберите питательную среду из одной лунки каждой клеточной линии в пробирку объемом 1,5 миллилитров. Собранные образцы центрифугируют при 10 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и переносят надосадочную жидкость в новую пробирку для хранения при температуре минус 20 градусов Цельсия. Промойте оставшиеся клетки в каждой лунке одним миллилитром холодного PBS, аккуратно аспирируйте и выбросьте PBS. Затем добавьте в каждую лунку по 200 микролитров буфера RIPA с добавлением 1% ингибитора протеазы и выдерживайте в течение пяти минут. Теперь соскребите клетки скребком для клеток и перемешайте лизат путем пипетирования несколько раз для гомогенизации. Соберите лизированные клетки в новую пробирку и медленно отсасывайте образец в двухмиллилитровый шприц, оснащенный иглой 21 калибра размером 0,8 на 40 миллиметров. После пяти-10 аспирации собранные образцы центрифугируют при 10 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и переложите надосадочную жидкость в новую пробирку для хранения при температуре минус 20 градусов Цельсия. Развести захватывающее антитело Anti-HER2 до одного микрограмма на миллилитр в кодирующем буфере. С помощью многоканальной пипетки добавьте по 100 микролитров раствора захватывающего антитела в каждую лунку 96-луночного планшета для ИФА. Накройте пластину герметизирующей пленкой. Инкубируйте тарелку на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. После ночной инкубации поместите пластину при комнатной температуре на горизонтальный шейкер для микропланшетов на один час. С помощью промывки для микропланшетов отсадите раствор для покрытия и трижды промойте каждую лунку 300 микролитрами PBST. Затем с помощью многоканальной пипетки добавьте 100 микролитров блокирующего буфера, содержащего 5% обезжиренного сухого молока PBS, в каждую лунку с покрытием, чтобы блокировать неспецифические участки связывания. Теперь подготовьте калибровочную кривую и положительный контроль. Добавьте два микролитра по одному миллиграмм на миллилитр, стоковый раствор HER2 к 1998 микролитрам PBS, чтобы получить рабочий стандартный раствор 1000 нанограмм на миллилитр. Для стандартных двух добавьте 500 микролитров стандартного первого к 500 микролитрам PBS и тщательно перемешайте, чтобы достичь концентрации 50 нанограммов на миллилитр. Подготовьте последовательное разбавление для генерации стандартов с третьего по седьмой. Затем готовят матричные образцы с использованием лизатов клеток PBS и питательной среды, обогащенной известными концентрациями HER2. Разбавьте клеточные лизаты от одного до 2000 2,5 микролитрами лизата и пятью миллилитрами PBS для получения уровней HER2 ниже предела обнаружения. Чтобы приготовить раствор в два нанограмма на миллилитр, добавьте восемь микролитров стандартного одного к 392 микролитрам питательной среды PBS или лизата клеток и тщательно перемешайте. Используя одноканальную пипетку, добавьте 100 микролитров стандартного бланка PBS и исследуйте образцы каждый в трех экземплярах в соответствующие лунки покрытой и заблокированной пластины ИФА. Через час при температуре 37 градусов Цельсия в камере влажности вымойте пластину с помощью мойки микроплит. Чтобы обнаружить связывание антител, разбавьте биотинилированное детектирующее антитело в PBS до рабочей концентрации один микрограмм на миллилитр. Затем с помощью многоканальной пипетки добавьте по 100 микролитров этого раствора детектирующих антител в каждую лунку. Затем разбавьте конъюгат AVID и HRP в соотношении от одного до 40 000 в 40 миллилитрах PBST. С помощью многоканальной пипетки добавьте в каждую лунку по 100 микролитров разведенного конъюгата. После инкубации и промывки планшета с помощью многоканальной пипетки добавьте в каждую лунку по 100 микролитров субстрата 3,3 5,5 тетраметилбензидина, чтобы инициировать цветометрическую реакцию. Затем накройте пластину герметизирующей пленкой. Инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной-пяти минут, защищая ее от света и следя за развитием цвета. Когда будет достигнута желаемая интенсивность цвета, добавьте по 100 микролитров стоп-раствора в каждую лунку, чтобы завершить реакцию. Наконец, измерьте поглощение на 450 нанометрах с помощью считывателя микропланшетов. Используя четырехпараметрическую калибровочную кривую, рассчитайте концентрацию образца на основе уравнения кривой. Разработанный сэндвич ИФА продемонстрировал рабочий диапазон для белка HER2 от 1,56 до 100 нанограммов на миллилитр с коэффициентом определения, равным единице, что указывает на отличное соответствие. Концентрация HER2 в культуральной среде со временем увеличивалась для всех испытуемых клеточных линий с наивысшими значениями через 72 часа. Клетки SK-OV-3 и SK-BR-3 показали примерно в десять и 50 раз более высокие концентрации HER2 соответственно по сравнению с клетками MDA-MB-231 в культуральной среде через 24 часа. Аналогичным образом, уровни HER2 в лизатах были примерно в три и пять раз выше для SK-OV-3 и SK-BR-3 соответственно. Интересно, что среда для культивирования клеток содержала в 1000 раз более низкие концентрации испытуемого антигена по сравнению с мембраносвязанным белком, обнаруженным в цельных клеточных лизатах.