Анализ экспрессии и сборки комплексов белков митохондриальной дыхательной цепи в делящихся дрожжах Schizosaccharomyces pombe

Предметом нашего исследования является трансляция митохондриального белка, и мы пытаемся выяснить механизмы, влияющие на трансляцию и сборку комплекса митохондриальной дыхательной цепи. Наше исследование показало, что shy1 играет роль в устойчивости регулярного функционирования митохондрий, участвуя в сборке сложных четырех инфузий. Наша лаборатория исследует механизм инфузии М=метотрексата.

[Рассказчик] Для начала измерьте вес во влажном состоянии клеточной гранулы Schizosaccharomyces pombe. Повторно суспендируйте клетки в восьми миллилитрах S-буфера. Добавьте дитиотреитол до конечной концентрации 10 миллимоляров и фенилметилсульфонилфторид до одного миллимольяра, убедившись, что оба реагента свежеприготовлены. Добавьте в клеточную суспензию литические ферменты для переваривания клеточной стенки Schizosaccharomyces pombe. Вращайте трубку на шейкере при температуре 30 градусов Цельсия в течение времени, рекомендованного для конкретного литического фермента. С помощью микроскопа наблюдайте за образованием сферопластов. Затем центрифугируйте образец в течение 10 минут при 1000 G, при 4 градусах Цельсия, чтобы гранулировать сферопласты. Повторно суспендируйте гранулу в восьми миллилитрах ледяного S-буфера. После двух промывок повторно суспендируйте сферопласты в восьми миллилитрах ледяного гомогенизационного буфера, содержащего ингибиторы протеазы. Переложите смесь в предварительно охлажденный гомогенизатор со стеклянным пухом, содержащий пестик, и пробирку. Механически гомогенизируйте клетки, выполнив примерно 15 движений вверх и вниз плотно прилегающим пестиком. Затем осмотрите сферопласты под микроскопом, чтобы проверить наличие разрывов мембраны. Теперь переложите гомогенизированную суспензию в центрифужные пробирки. Центрифугируйте в течение пяти минут при 1000 G при 4 градусах Цельсия, чтобы измельчить неповрежденные клетки и мусор. Центрифугируйте полученный надосадочный агент в течение пяти минут при 3000 G при 4 градусах Цельсия, чтобы гранулировать ядра. Затем переложите надосадочную жидкость в свежие центрифужные пробирки. Центрифугируйте при 12 000 G в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия для гранулирования митохондрий и других органелл, повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре ледяного сорбита ЭДТА буфера для швабры после сцеживания надосадочной жидкости. Затем снова центрифугируйте в течение 15 минут при 12 000 G при 4 градусах Цельсия, чтобы промыть митохондрии. Повторно суспендируйте конечную гранулу в одном миллилитре ледяного сорбита ЭДТА буфера для швабр. Затем поместите очищенные митохондрии в пробирки для хранения для будущих экспериментов. При загрузке страницы SDS буфер в 40 микролитров митохондриального общего белка. Денатурируйте белки путем инкубации смеси в течение указанного времени при соответствующей температуре. Загрузите примерно 20 микрограммов или четыре микролитра митохондриальных белков в 12% гель SDS перед иммуноблоттингом. Чтобы подготовить образец для страницы BN, сначала гранулируют митохондрии из предыдущих аликвот методом центрифугирования. Повторно суспендируйте митохондрии в 200 микролитрах трех страниц гелевого буфера XBN. Далее пипеткой наберите два микролитра 100 х фенилметилсульфонилфторида и один микролитр одного моляра хлорида магния. Снова центрифугируйте в течение 15 минут при 12 000 G при 4 градусах Цельсия. Повторно суспендировать митохондриальную гранулу в 160 микролитрах 5% от массы по объему пальцев. Выдерживайте на льду в течение 30 минут, аккуратно перемешивая каждые 10 минут. Центрифугируйте суспензию в течение пяти минут при 20 000 G при 4 градусах Цельсия. Затем переложите надосадочную жидкость в свежую трубку. Добавьте 80 микролитров буфера из трех страниц образца XBN к обработанному образцу digitorum. Или 32 микролитра на образец, обработанный ДДМ. Теперь соберите сборные нативные гели Bis-Tris с уклоном от 3 до 12%. Загрузите обработанные образцы белка вместе с высокомолекулярными белковыми маркерами для электрофореза в нативном полиакриламидном геле. Запустите гель при постоянном напряжении 80 вольт и токе в шесть миллиампер в течение 30 минут с помощью катодного буфера, содержащего 0,02% Kumasi G250. Замените буфер на катодный буфер без Кумаси и продолжайте работать при давлении 10 миллиампер в течение трех часов, пока фронт красителя не достигнет гелевого дна. Разрежьте гелевую дорожку, содержащую белковый маркер. Окрасьте маркер буфером Kumasi R250 на 15 минут. Затем удаляйте пятна до тех пор, пока полосы не станут видимыми. Погрузите оставшуюся часть геля в буфер переноса страницы BN на 30 минут для балансировки. Промойте мембрану PVDF размером 0,45 мкм с метанолом и отбалансируйте в буфере для переноса в течение 10 минут. Переносите белки из геля на мембрану PVDF с помощью постоянного тока 300 миллиампер в течение двух часов. Промойте мембрану PVDF метанолом, чтобы удалить краситель Kumasi. Затем инкубируйте мембрану в блокирующем буфере TBS, содержащем 5% обезжиренного молока, в течение одного часа при температуре 25 градусов Цельсия. Инкубируют мембрану PVDF с указанными первичными антителами против комплексов митохондриальной дыхательной цепи Schizosaccharomyces pombe. После ночной инкубации при четырех градусах Цельсия промойте мембрану с помощью буфера TBST. Затем инкубируют мембрану во вторичном антителе в разведении от одного до 10 000 в течение одного часа при температуре 25 градусов Цельсия. После промывки мембраны буфером TBST обнажите и отсканируйте мембрану PVDF для визуализации результатов иммуноблоттинга. Делеция гена shy1 привела к заметному снижению уровней в устойчивом состоянии белков дыхательной цепи, кодируемых митохондриальной ДНК, Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 и Atp6. Анализ Blue Native Page показал, что в клетках Delta shy1 было снижено количество суперкомплексов DG Solubilized respiratory chain 3242 и 324. В то время как уровни суперкомплексов 32.=, и 55Н остались нетронутыми. Уровень растворенного ДДМ диаметрального комплекса 3 не изменился в штамме Дельта Шый1.