Флуоресцентная матричная лазерная десорбция/ионизация с лазерно-индуцированной постионизационной масс-спектрометрией отдельных нервных клеток крыс

Наши исследования сосредоточены на разработке высокопроизводительных рабочих процессов масс-спектрометрии MALDI для отдельных клеток с визуальным контролем, чтобы выявить клеточную гетерогенность и связать молекулярные профили с идентичностью, функцией и реакцией клеток в сложных системах.

Передовые приборы, такие как MALDI-2 и масс-спектрометры с высоким пространственным разрешением, позволяют проводить целенаправленный анализ отдельных клеток с пространственным разрешением, повышая чувствительность и расширяя область молекулярного профилирования в сложных тканях. Текущие проблемы включают ограниченную чувствительность, воспроизводимость образцов и сложный анализ данных. Данные MALDI часто разрозненны, а большие наборы данных с тысячами клеток и сотнями молекул требуют надежных вычислительных инструментов.

Этот протокол устраняет пробел в высокопроизводительных методах анализа отдельных клеток и даже органелл, позволяя проводить очень детальные исследования гетерогенности и получать представление о молекулярной и клеточной биологии и функциях.

Этот протокол позволяет проводить быстрый целенаправленный анализ клеток, разбросанных по предметному стеклу, устраняя необходимость в манипуляциях с клетками или сканировании всей площади и значительно увеличивая производительность.

[Рассказчик] Для начала промойте каждое предметное стекло двумя-тремя миллилитрами 150 миллимоларного ацетата аммония, чтобы удалить кристаллы глицерина и соли, которые могут помешать микроскопии и нанесению матрицы MALDI, затем высушите предметные стекла под слабой струей азота или дайте им полностью высохнуть на воздухе. Загрузите высушенное предметное стекло в предметный столик микроскопа. Сфокусируйте микроскоп, используя не менее 10 опорных точек, равномерно распределенных по всему предметному стеклу. Используя фильтры, подходящие для DAPI и визуализации в светлом поле, получите мозаичное флуоресцентное изображение всего предметного стекла с увеличением от 5 до 10 раз, гарантируя, что реперные маркеры на предметных стеклах микроскопии будут четко запечатлены на изображении. Сшивайте мозаичные изображения с помощью программного обеспечения для микроскопии, такого как ZEN ZEISS. Убедитесь, что вертикально расположенные рядом плитки не смещены. Обработайте и экспортируйте каждое сшитое изображение в виде файла BigTIFF с помощью программного обеспечения для микроскопии или в виде стандартного TIFF, если окончательный размер изображения составляет менее двух гигабайт. Растворите 20 миллиграммов 2,5-дигидроксиацетофенона в 1,5 миллилитрах ацетона. Поместите предметные стекла в держатель сублимационной камеры, затем поместите держатель в сублимационный аппарат. Нанесите растворенный матричный раствор на керамическую пластину пипеткой и дайте ацетону полностью испариться, затем закройте камеру сублимации, чтобы запечатать ее. Заполните камеру охлаждающей жидкости ледяной водой и надежно разместите ее поверх камеры сублимации. Включите вакуумный насос и дайте системе уравновеситься в течение пяти минут. Начните сублимацию с нагрева камеры до 200 градусов Цельсия в течение пяти минут. Через пять минут достаньте ледяную водяную баню из камеры. Увеличьте температуру до 25 градусов по Цельсию и поставьте радиатор на верхнюю часть камеры. Медленно проветрите камеру сублимации, чтобы сбросить давление. Откройте камеру и осторожно снимите предметные стекла. Откройте MicroMS и уменьшите микроскопические изображения BigTIFF с помощью опции группы изображений, чтобы охватить как светлопольные, так и флуоресцентные каналы. Перейдите к средству "Параметры большого двоичного объекта" и настройте максимальный и минимальный размер большого двоичного объекта, чтобы определить допустимый диапазон размеров больших двоичных объектов. Установите пороговое значение флуоресцентного канала для обнаружения больших двоичных объектов. Укажите значение круговости, чтобы определить, насколько круглыми должны быть идентифицированные ячейки для рассмотрения, и выберите цвет. Используйте параметр Поиск BLOB-объектов для обнаружения BLOB-объектов. При появлении запроса сохраните список BLOB-объектов под нужным именем. Используйте инструмент «Фильтр расстояний», чтобы установить минимальное расстояние между каждой ячейкой. Проверьте ошибку с помощью контрольных точек, чтобы точно определить ошибку смещения. Загрузите слайды в прибор с помощью адаптера MTP Slide Adapter II. Вернувшись к компьютеру с MicroMS, получите доступ к компьютеру масс-спектрометра через приложение удаленного рабочего стола. Если вы используете инструмент впервые, проверьте его положение, перейдя в раздел «Инструменты», а затем в «Настройки инструмента». Во всплывающем окне просмотрите набор координат с их позициями по осям X и Y и выберите каждую из этих конкретных точек на геометрии Slide Adapter II. Обновите положения X и Y в окне MicroMS. Используя камеру масс-спектрометра и элементы управления сценой, перейдите к легко идентифицируемому месту на слайде и скопируйте координаты прибора. В MicroMS найдите ту же позицию на изображении микроскопа, щелкните правой кнопкой мыши и введите координаты во всплывающем окне. Округлите координаты до ближайших целых чисел и разделите их пробелом. После того, как будут добавлены три точки регистрации, один из кругов станет красным, указывая на то, что это наиболее невыгодная позиция от регистрации. Удалите точку регистрации с помощью Control + щелчок правой кнопкой мыши и повторите попытку. В разделе Файл перейдите в раздел Сохранить, а затем Регистрация, чтобы сохранить файл регистрации. Когда большие двоичные объекты видны на слайде, перейдите в раздел «Файл», «Сохранить», а затем «Положение прибора», чтобы сохранить файл положения инструмента, а затем с помощью программного обеспечения удаленного рабочего стола перенесите этот файл на компьютер прибора. Откройте пользовательский файл XEO и скопируйте его содержимое в MTP Slide Adapter II. XEO на компьютере прибора. Сохраните файл, чтобы обновить файл геометрии с указанием местоположения ячеек. Перейдите на вкладку «Автоматизация» и выберите «Создать», чтобы создать новый автоматический запуск. Перетащите курсор через отображаемую область выборки, чтобы выбрать ячейки, и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы добавить их в список анализа. Сохраните автоматический прогон и нажмите «Начать автоматический прогон», чтобы начать сбор. Этот рисунок иллюстрирует, как масс-спектрометрическое профилирование одиночных клеток MALDI-2 выявляет клеточную гетерогенность на основе липидов в различных областях мозга и внутри них. Равномерная аппроксимация и проекция многообразия, или анализ UMAP, разделяет клетки по областям мозга, образуя отдельные кластеры для стриатума, гиппокампа и коры головного мозга. Лейденская кластеризация выявила четыре субпопуляции клеток на основе липидов. Кроме того, наблюдались кластерно-специфичные липидные сигнатуры с четкими профилями интенсивности аннотированных липидов. Масс-спектры из шести корковых клеток также показали последовательное обнаружение липидов на предметных стеклах. Кроме того, корковые клетки с разных слайдов показали перекрывающиеся распределения UMAP, что указывает на минимальные пакетные эффекты.