Выделение корковых микроглии с сохранившимися иммунофенотипа и функциональности из мышиных новорожденных
30 января 2014 г.
Одним из ключей к успешной расследования микроглии биологии является сохранение микроглии immunofunction экс естественных условиях в процессе выделения из ткани ЦНС. Изоляция микроглии через ротационным качанием результатов в высокочистых и immunofunctional клеточных культурах по оценке флуоресцентных изображений, иммуноцитохимии и ELISA после активации микроглии с провоспалительных стимулов липополисахарида (ЛПС) и Пэм 3 ЦСК 4 (Пэм).
Общая цель данной процедуры — выделение микроглии коры головного мозга из новорожденных мышей. Это достигается путем предварительного микродиссекции тканей коры головного мозга новорожденных мышей. На втором этапе выращивают смешанные культуры глиальных клеток в течение 17–21 дня in vitro.
Затем из этих смешанных глиальных культур выделяют микроглию. Заключительным этапом является высев клеток микроглии в планшеты для культивирования клеток для дальнейших экспериментов. В конечном итоге с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии и метода ELISA демонстрируют, что данный протокол выделения позволяет сохранить иммунофенотип и функциональность микроглии.
Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, поскольку этапы, связанные с микродиссекцией, трудновыполнимы. Успешное проведение этой процедуры требует как скорости, так и точности. Слишком медленная работа приведет к снижению выхода клеток, в то время как неполное удаление мозговых оболочек приведет к загрязнению глиальной культуры и будет препятствовать росту глии.
Начните с приготовления полной среды для микроглии, далее именуемой MCM. Подготовьте по одной колбе на каждого щенка и инкубируйте их в течение не менее одного часа. Этот этап уравновешивания имеет решающее значение для достижения успешного результата.
Затем подготовьте аликвоты и охладите их на льду. Для всех необходимых сред отмерьте по 6 mL MCM для каждого щенка и прогрейте в водяной бане при 37 °C перед проведением диссекции. Протрите рабочую станцию с горизонтальным потоком воздуха и диссекционный микроскоп 70% этанолом.
Затем поместите в рабочую зону стерилизованные хирургические инструменты, необходимые для процедуры. Подготовьте стерильную чашку со средой для диссекции для фиксации головы и еще одну чашку для проведения самой диссекции. Перелейте среду для измельчения в отдельную чашку для измельчения ткани мозга.
После декапитации и извлечения мозга поместите свежевыделенный мозг под диссекционный микроскоп для визуализации структур, убедившись, что дорсальная сторона обращена вверх и остается сухой. Зафиксируйте мозг, введя кончики пинцета в область перехода среднего мозга в кору. После фиксации полностью удалите дорсальные мозговые оболочки коры.
Далее удалите вентральные мозговые оболочки, чтобы максимально повысить чистоту и выход микроглии. Необходимо полностью удалить все ткани мозговых оболочек. Отделите кору от остальной части головного мозга.
Обязательно удалите любые остатки мозговых оболочек, которые могут находиться на вентральной или медиальной стороне коры. После удаления тканей оболочек поместите кору в заранее подготовленную чашку для измельчения. Working in a class two biological safety cabinet, используя ножницы, измельчите ткани головного мозга в ламинарном шкафу второго класса биологической безопасности.
Перенесите измельченную ткань в коническую пробирку объемом 15 мл. Промойте ножницы и чашку для измельчения, используя по 1 мл среды для измельчения для каждой, чтобы максимально увеличить выход продукта. Соберите эти промывочные растворы и перенесите их в коническую пробирку объемом 15 мл с измельченной тканью.
Оставьте суспензию ткани в покое на одну-две минуты, чтобы измельченная ткань осела на дно пробирки. По истечении этого времени аккуратно удалите и утилизируйте 2 мл супернатанта, стараясь не задеть осевшую измельченную ткань. Добавьте 3 мл предварительно нагретого MCM к измельченной ткани, после чего интенсивно тритурируйте ткань.
После завершения процедуры трирования видимых остатков твердой ткани оставаться не должно. Добавьте еще три миллилитра MCM тем же наконечником пипетки, чтобы собрать остатки измельченного образца с наконечника. После сбора центрифугируйте измельченную ткань для осаждения клеток.
По завершении перенесите осадок клеток обратно в бокс биологической безопасности. Осторожно удалите и утилизируйте супернатант. Аккуратно ресуспендируйте.
Ресуспендируйте осадок клеток в двух миллилитрах подогретой среды MCM, после чего добавьте полученную суспензию клеток в подготовленную ранее колбу. Инкубируйте клетки в течение 24 часов. По истечении 24 часов осторожно постучите колбой по ладони, чтобы разрушить остатки тканей.
Проверьте клетки до и после постукивания, чтобы убедиться в полном удалении клеточного дебриса. Затем замените среду на свежую MCM и верните флакон в инкубатор. Ежедневно проверяйте клетки для мониторинга их роста и отсутствия контаминации.
Примерно через 17–21 день микроглиальные клетки будут готовы к сбору; чтобы определить готовность клеток, изучите их под инвертированным фазово-контрастным микроскопом. Микроглия готова к сбору, когда она достигает примерно 40% конфлюэнтности, при этом клетки выглядят как мелкие светлые сферические клетки, растущие в виде монослоя друг на друге.
Для выделения микроглии колбу интенсивно постукивают о лабораторный стол. Такое воздействие способствует отделению микроглии от других глиальных клеток благодаря низкой адгезивности микроглии. Крышки колб запечатывают парафильмом, после чего смешанные культуры глии подвергают перемешиванию в ротационном шейкере с контролируемой температурой без увлажнения в течение пяти часов.
По истечении этого времени визуально убедитесь, что микроглия отделилась от поверхности флакона. При наблюдении с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа микроглия выглядит как яркие сферические свободно плавающие клетки. На дне флакона останется слой адгезированных астроцитов и олигодендроцитов.
Затем соберите супернадант, содержащий микроглию, в стерильную коническую центрифужную пробирку и центрифугируйте. Ресуспендируйте осадок микроглии в теплом питательной среде для роста микроглии и определите концентрацию клеток с помощью камеры Гольдмана — Грайу. Посейте клетки на 24-луночный планшет на пластик или стерильные стеклянные покровные стекла, после чего выждите 24 часа.
Замените среду на свежую теплую MGM, чтобы удалить плавающие клетки и клеточный детрит. Этот этап имеет решающее значение для выживания клеток и поддержания микроглии в состоянии покоя; сразу после этого этапа подпитки клетки микроглии готовы к проведению экспериментов для оценки чистоты культуры. Клеточные культуры, полученные из микроглии с эндогенной экспрессией GFP, окрашивали на макрофагальный антиген IBA1 и доокрашивали DAPI.
Для визуализации клеточного ядра более 95% клеток продемонстрировали колокализацию GFP IBA1 и dpi. После воздействия LPS микроглия претерпела резкое морфологическое изменение, перейдя от небольшого биполярного фенотипа к амебоидной форме. Иммуногистохимическое окрашивание на P65 свидетельствует о том, что в нормальных условиях P65 диффузно локализован по всей цитоплазме.
В то время как после двухчасового воздействия Pam P 65 иммунореактивность резко сместилась в ядро клетки, чтобы подтвердить, что изолированная микроглия сохранила свою биохимическую иммунофункциональность. Секреция про-воспалительного цитокина TNF alpha определялась после воздействия PAM или LPS. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как изолировать микроглию коры головного мозга новорожденных мышей для достижения наилучших результатов.
Важно соблюдать правила стерильности и тщательно удалить мозговые оболочки из диссекированной области коры.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается процедура выделения микроглии коры головного мозга новорожденных мышей с акцентом на важности сохранения иммунофункции микроглии в процессе выделения. Метод выделения включает микродиссекцию тканей мозга, культивирование смешанных глиальных клеток и последующее выделение микроглии для проведения экспериментов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Клеточная биология
- Иммунология
Теоретические сведения
- Микроглия играет важную роль в центральной нервной системе (ЦНС).
- Методы выделения могут влиять на функциональную активность микроглиальных клеток.
- Сохранение иммунофункции необходимо для получения точных результатов экспериментов.
- Для оценки активации микроглии используются провоспалительные стимулы.
Цель исследования
- Разработать надежный протокол выделения микроглии из тканей новорожденных мышей.
- Обеспечить сохранение иммунофенотипа и функциональной активности выделенной микроглии.
- Создать основу для дальнейших исследований биологии микроглии.
Используемые методы
- Микродиссекция тканей коры головного мозга новорожденных мышей.
- Культивирование смешанных глиальных клеток в течение 17–21 дня in vitro.
- Изоляция микроглии из смешанных глиальных культур.
- Использование иммунофлуоресцентной микроскопии и метода ELISA для оценки функционального состояния микроглии.
Основные результаты
- Протокол выделения позволяет получить высокочистые культуры микроглии.
- После выделения микроглия сохраняет свои иммунофункциональные характеристики.
- Активация с помощью LPS и Pam 3 CSK 4 подтверждает сохранность функциональности.
- Результаты подтверждаются методами флуоресцентной визуализации и иммуноцитохимии.
Выводы
- Описанный метод выделения эффективен для получения функциональной микроглии.
- Сохранение иммунофункции имеет решающее значение для изучения биологии микроглии.
- Данный протокол может быть применен в различных экспериментальных моделях с использованием микроглии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Выделение функциональной микроглии из новорожденных мышей позволяет снизить механистические риски при валидации мишеней в нейроиммунологии за счет сохранения иммунофенотипа и реактивности на воспалительные стимулы. Данная модель ex vivo повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска за счет поддержания состояний покоя и активации, имеющих значение для патогенеза заболеваний ЦНС. Этот метод представляет собой релевантную с точки зрения патологии систему для скрининга иммуномодулирующих соединений и оценки взаимодействия с мишенью в рамках доклинических исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать пути активации микроглии с помощью анализов, основанных на воздействии LPS и Pam3CSK4.
- Практическая ценность: обеспечивает получение высокочистой микроглии коры головного мозга с сохраненной функциональностью ядерной транслокации NF-κB p65 и секреции TNF-α.
- Прогностическая ценность: способствует проверке гипотез о мишенях за счет сохранения иммунофенотипической точности при переходе от состояния покоя к провоспалительному состоянию.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает стандартизированную систему монослоя микроглии для скрининга соединений после 17–21 дней созревания глиальной культуры.
- Практическая ценность: Позволяет количественно определить чистоту микроглии с помощью колокализации IBA-1/GFP (>95%) и функциональных показателей, таких как высвобождение цитокинов.
- Готовность анализа: Изолированная микроглия демонстрирует морфологические и функциональные ответы на стимулы, что позволяет проводить надежное профилирование зависимости «доза — ответ».
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная ценность: Позволяет поддерживать функциональность микроглии ex vivo, обеспечивая преемственность от этапа поиска до доклинической валидации мишеней нейровоспаления.
- Снижение механистических рисков: Сохраняет биохимическую функциональность (сигналинг NF-κB, высвобождение TNF-α), критически важную для оценки модуляции путей, опосредованных мишенью.
- Релевантность заболеванию: Позволяет моделировать состояния покоящейся и активированной микроглии, что применимо при исследовании нейродегенеративных и нейровоспалительных заболеваний.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Метод изоляции вписывается в континуум разработки препаратов — от валидации мишени до идентификации соединений-лидеров, предоставляя воспроизводимую платформу микроглии для изучения механизмов действия и фенотипического скрининга в нейроиммунологии.
- Биология открытий: Обеспечивает уточнение сигнальных путей с помощью анализа транслокации NF-κB и секреции цитокинов после иммунного воздействия.
- Скрининг: Позволяет стандартизировать анализ за счет стабильного выхода, чистоты и функционального ответа микроглии после выделения с помощью роторного шейкера.
- Аналитика: Позволяет получить количественные зависимые переменные, включая уровни секреции TNF-α и ядерную локализацию p65 для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: Связывают функцию микроглии ex vivo с релевантностью in vivo за счет сохранения иммунофенотипа и кинетики активации.
- Корпоративное использование: Устанавливает воспроизводимый рабочий процесс выделения микроглии, применимый в рамках нескольких кампаний по валидации мишеней в ЦНС.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности валидации мишеней за счет сохранения иммунофенотипа микроглии и её функционального отклика на стимулы.
- Практическая ценность: Стандартизированная изоляция с помощью механического перемешивания позволяет получать воспроизводимые культуры микроглии с чистотой >95% и сохраненной функциональной целостностью.
- Стратегическая ценность: Снижение механистической неопределенности при скрининге в области нейроиммунологии за счет поддержания поведения микроглии ex vivo, соответствующего состояниям in vivo.
- Влияние на портфель разработок: Обеспечивает приоритизацию иммуномодулирующих мишеней с учетом рисков на основе подтвержденного взаимодействия с мишенью в функциональных анализах микроглии.
Особенности реализации
- Требуется опыт в препарировании тканей новорожденных мышей и методах стерильного культивирования глии.
- Для выделения и верификации микроглии необходимы ротационный шейкер с контролем температуры и инвертированный фазово-контрастный микроскоп.
- Для обеспечения выхода и чистоты микроглии необходима стандартизация процесса удаления мозговых оболочек и длительности культивирования (17–21 день) во всех рабочих группах.
- Адаптация к другим модельным системам может потребовать оптимизации времени диссоциации и свойств адгезии микроглии.
- Практическое ограничение: выход микроглии зависит от полного удаления тканей мозговых оболочек для предотвращения контаминации глиальной культуры.
