Выделение корковых микроглии с сохранившимися иммунофенотипа и функциональности из мышиных новорожденных
30 января 2014 г.
Одним из ключей к успешной расследования микроглии биологии является сохранение микроглии immunofunction экс естественных условиях в процессе выделения из ткани ЦНС. Изоляция микроглии через ротационным качанием результатов в высокочистых и immunofunctional клеточных культурах по оценке флуоресцентных изображений, иммуноцитохимии и ELISA после активации микроглии с провоспалительных стимулов липополисахарида (ЛПС) и Пэм 3 ЦСК 4 (Пэм).
Общая цель этой процедуры заключается в выделении кортикальной микроглии у мышиных новорожденных. Это достигается с помощью первых микрочастиц, рассекающих кортикальную ткань мозга у новорожденных с болезнью Мурен. Второй шаг заключается в выращивании смешанных культур глиальных клеток в течение 17-21 дня in vitro.
Затем микроглии выделяют из этих смешанных глиальных культур. Заключительным этапом является помещение микроглиальных клеток в планшеты для клеточных культур для дальнейших экспериментов. В конечном счете, с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии и Элизы было показано, что этот протокол изоляции сохраняет иммунофенотип и функциональность микроглии.
Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку SEP, участвующие в микродиссекции, трудно выполнить. Успешное выполнение этой процедуры требует как скорости, так и точности. Это означает, что слишком медленный подход приведет к снижению выхода клеток, в то время как неполное удаление мозговых оболочек приведет к загрязнению глиальной культуры и затруднит рост глии.
Начните с подготовки полной среды микроглии, которая далее будет называться MCM. Приготовьте одну колбу на каждого щенка и высиживайте их не менее одного часа. Этот шаг уравновешивания имеет важное значение для успеха.
Далее приготовьте аликвоту и охладите на льду. Все необходимые среды аликвотируют шесть миллилитров МКМ на каждого щенка и подогревают на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия перед вскрытием. Протрите горизонтальную рабочую станцию и микроскоп для препарирования 70% этанолом.
Затем поместите стерилизованные хирургические инструменты, необходимые для процедуры, в рабочую зону. Подготовьте стерильную чашку с диссекционными средами для захвата головы и другую для вскрытия. Раздайте измельченную среду в отдельную чашку для измельчения мозговой ткани.
После обезглавливания и извлечения мозга поместите только что изолированный мозг под препарирующий микроскоп, чтобы визуализировать любезности, следя за тем, чтобы спинная сторона оставалась сухой и высокой. Обезопасьте мозг, вставив кончики щипцов в место пересечения среднего мозга и коры головного мозга. Оказавшись на месте, полностью удалите спинные мозговые оболочки коры головного мозга.
Затем удалите вентральные мозговые оболочки для максимальной чистоты микроглии и ее выхода. Важно полностью удалить всю менингеальную ткань. Отделите кору головного мозга от остальной части мозга.
Обязательно удалите любые остаточные мозговые оболочки коры головного мозга, которые могут присутствовать на вентральной или медиальной стороне коры головного мозга. Удалив менингеальную ткань, поместите кортикальные средства в приготовленную ранее форму для фарша. Работая в шкафу биологической безопасности второго класса, используйте ножницы, чтобы измельчить мозговую ткань.
Переложите измельченную ткань в 15-миллиметровую коническую трубку. Промойте ножницы и форму для фарша одним миллилитром измельчителя каждая, чтобы получить максимальный выход. Соберите и распределите эти полоскания в коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую измельченную салфетку.
Оставьте тканевую суспензию в покое на одну-две минуты, дав измельченной ткани осесть на дне трубки. По истечении этого времени аккуратно извлеките и выбросьте два миллилитра надосадочной жидкости, стараясь не нарушить осевшую измельченную ткань. Добавьте в измельченную салфетку три миллилитра предварительно подогретого МЦМ, а затем с усилием взбейте ткань.
После завершения триера не должно оставаться заметных твердых тканей. Добавьте еще три миллилитра MCM с помощью того же наконечника для дозатора, чтобы собрать остаточный растиранный образец с наконечника. После сбора центрифугируйте измельченную ткань, чтобы гранулировать клетки.
По завершению верните гранулированные клетки в бокс биологической безопасности. Осторожно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость. Аккуратно ресус.
Суспензируйте клеточную гранулу двумя миллилитрами теплого МЦМ, а затем добавьте клеточную резусную суспензию в подготовленную ранее колбу. Инкубируйте клетки в течение 24 часов. Через 24 часа осторожно постучите колбой по ладони, чтобы разрушить остатки ткани.
Проверьте ячейки до и после постукивания, чтобы убедиться, что мусор полностью удален. Далее замените фильтрующий материал на свежий МЦМ и верните колбу в инкубатор. Ежедневно проверяйте клетки для контроля роста и загрязнения.
Примерно через 17-21 день микроглиальные клетки будут готовы к забору, чтобы определить, готовы ли клетки, исследовать их под инвертированным фазово-контрастным микроскопом. Микроглия готова к сбору урожая. Когда они достигают примерно 40% беглости речи, они выглядят как маленькие, яркие сферические клетки, растущие как монослой поверх других.
Чтобы изолировать, микроглию энергично постукивают колбой по лабораторному столу. Это перемешивание помогает отделить микроглию от других глиальных клеток благодаря низким адгезивным свойствам микроглии. Запечатайте крышки колб параформой и переворачивайте смешанные глиальные культуры с помощью неувлажненного ротационного шейкера с регулируемой температурой в течение пяти часов.
По истечении этого времени визуально осмотрите на предмет того, чтобы микроглия оторвалась от поверхности колбы. С помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа микроглия представляет собой яркие сферические свободно плавающие клетки. На дне колбы будет остаточный слой астроцитов и олигодендроцитов.
Затем соберите надосадочную жидкость, содержащую микроглию, в стерильную коническую центрифужную пробирку и небо. Ресус. Суспензируйте микроглиальную гранулу в теплой микроглиальной среде для роста и определите концентрацию клеток с помощью планшета гемоцитометра. Ячейки на 24-луночном планшете на пластиковой или стерильной стеклянной крышке сползают через 24 часа.
Замените фильтрующий материал на свежий теплый MGM, чтобы удалить плавающие элементы и мусор. Этот этап имеет решающее значение для выживания клеток, и для поддержания покоя микроглии клетки микроглии готовы к экспериментам сразу после этого этапа повторного кормления для оценки чистоты микроглии. Клеточные культуры, полученные из микроглии, эндогенно экспрессирующей GFP, окрашивали на макрофагальный антиген IBA one и противоокрашивали dapi.
Для визуализации ядра клетки более 95% клеток продемонстрировали колокализацию GFP IBA one и dpi. После того, как клетки были подвергнуты воздействию ЛПС, микроглия претерпела резкое морфологическое изменение от маленького бифенотипа до амебоидной формы. Иммунофитохимическое окрашивание на Р65 свидетельствует о том, что в нормальных условиях Р65 диффузно локализуется по всей цитоплазме.
В то время как после двухчасового воздействия Pam P 65 иммунореактивность резко сместилась в ядро клетки, что подтвердило, что изолированная микроглия сохранила свою биохимическую иммунофункциональность. Секрецию провоспалительного цитокина TNF альфа определяли после воздействия PAM или LPS. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как изолировать кортикальную микроглию от зеркального новорожденного для достижения наилучших результатов.
Важно соблюдать стерильную технику и тщательно удалять менингеальную ткань из рассеченной корковой области.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Эта статья описывает процедуру изоляции кортикальных микроглии из неонатов мышей, подчеркивая важность сохранения иммунной функции микроглии в процессе. Метод изоляции включает микросекцию ткани головного мозга, культивирование смешанных глиальных клеток и последующую изоляцию микроглии для эксперимента.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Невронауки
- Клеточная биология
- Иммунология
Фон
- Микроглии играют важную роль в центральной нервной системе (ЦНС).
- Методы изоляции могут влиять на функциональность клеток микроглии.
- Сохранение иммунной функции важно для точных результатов экспериментов.
- Противовоспалительные стимулы используются для оценки активации микроглии.
Цель исследования
- Разработать надежный протокол изоляции микроглии из неонатов мышей.
- Обеспечить, чтобы изолированная микроглия сохраняла свой иммунофенотип и функциональность.
- Облегчить дальнейшие эксперименты по биологии микроглии.
Используемые методы
- Микросекция кортикальной ткани головного мозга у неонатов мышей.
- Культивирование смешанных глиальных клеток в течение 17-21 дня in vitro.
- Изоляция микроглии из смешанных глиальных культур.
- Использование иммунофлуоресцентной микроскопии и ELISA для оценки функциональности микроглии.
Основные результаты
- Протокол изоляции дает высоко чистые культуры микроглии.
- Микроглии сохраняют иммунные характеристики после изоляции.
- Активация с помощью LPS и Pam 3 CSK 4 демонстрирует сохраненную функциональность.
- Флуоресцентное изображение и иммуноцитохимия подтверждают результаты.
Выводы
- Описанный метод изоляции эффективен для получения функциональной микроглии.
- Сохранение иммунной функции важно для изучения биологии микроглии.
- Этот протокол может быть применен к различным экспериментальным настройкам с участием микроглии.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Isolation of functional microglia from murine neonates enables mechanistic de-risking in neuroimmunology target validation by preserving immunophenotype and responsiveness to inflammatory stimuli. This ex vivo model supports predictive confidence in early discovery by maintaining quiescent and activated states relevant to CNS disease pathways. The method provides a disease-relevant system for screening immunomodulatory compounds and assessing target engagement in preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microglial activation pathways through LPS and Pam3CSK4 challenge assays.
- Operational Value: Yields highly pure cortical microglia with preserved NF-κB p65 nuclear translocation and TNF-α secretion functionality.
- Predictive Value: Supports target hypothesis testing by maintaining immunophenotypic fidelity from quiescent to proinflammatory states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized microglial monolayer system for compound screening after 17–21 days of glial culture maturation.
- Operational Value: Allows quantification of microglial purity via IBA-1/GFP colocalization (>95%) and functional readouts like cytokine release.
- Assay Readiness: Isolated microglia exhibit morphological and functional responses to stimuli, enabling reliable dose-response profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains microglial functionality ex vivo, supporting continuity from discovery to preclinical validation of neuroinflammatory targets.
- Mechanistic De-risking: Preserves biochemical functionality (NF-κB signaling, TNF-α release) critical for assessing target-mediated pathway modulation.
- Disease Relevance: Models quiescent and activated microglia states applicable to neurodegenerative and neuroinflammatory disease research.
Pipeline & Workflow Integration
The isolation method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification by providing a reproducible microglial platform for mechanism-of-action studies and phenotypic screening in neuroimmunology.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification via NF-κB translocation and cytokine secretion assays following immune challenge.
- Screening: Enables assay standardization through consistent microglial yield, purity, and functional responsiveness after rotary shaker isolation.
- Analytics: Generates quantitative dependent variables including TNF-α secretion levels and p65 nuclear localization for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects ex vivo microglial function to in vivo relevance through preserved immunophenotype and activation kinetics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microglial isolation workflow applicable across multiple CNS target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through preserved microglial immunophenotype and stimulus-responsive functionality.
- Operational Value: Standardized isolation via mechanical agitation yields reproducible microglial cultures with >95% purity and functional integrity.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuroimmunology screening by maintaining ex vivo microglial behavior indicative of in vivo states.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory targets based on validated target engagement in functional microglial assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal murine tissue dissection and sterile glial culture techniques.
- Dependent on temperature-controlled rotary shaker and inverted phase contrast microscopy for microglia isolation and verification.
- Necessitates standardization of meninges removal and culture duration (17–21 days) across teams to ensure microglial yield and purity.
- Adaptation to other model systems may require optimization of dissociation timing and microglial adhesion properties.
- Practical limitation: Microglial yield is contingent on complete meningeal tissue removal to prevent glial culture contamination.
