Выделение корковых микроглии с сохранившимися иммунофенотипа и функциональности из мышиных новорожденных

Общая цель этой процедуры заключается в выделении кортикальной микроглии у мышиных новорожденных. Это достигается с помощью первых микрочастиц, рассекающих кортикальную ткань мозга у новорожденных с болезнью Мурен. Второй шаг заключается в выращивании смешанных культур глиальных клеток в течение 17-21 дня in vitro.

Затем микроглии выделяют из этих смешанных глиальных культур. Заключительным этапом является помещение микроглиальных клеток в планшеты для клеточных культур для дальнейших экспериментов. В конечном счете, с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии и Элизы было показано, что этот протокол изоляции сохраняет иммунофенотип и функциональность микроглии.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку SEP, участвующие в микродиссекции, трудно выполнить. Успешное выполнение этой процедуры требует как скорости, так и точности. Это означает, что слишком медленный подход приведет к снижению выхода клеток, в то время как неполное удаление мозговых оболочек приведет к загрязнению глиальной культуры и затруднит рост глии.

Начните с подготовки полной среды микроглии, которая далее будет называться MCM. Приготовьте одну колбу на каждого щенка и высиживайте их не менее одного часа. Этот шаг уравновешивания имеет важное значение для успеха.

Далее приготовьте аликвоту и охладите на льду. Все необходимые среды аликвотируют шесть миллилитров МКМ на каждого щенка и подогревают на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия перед вскрытием. Протрите горизонтальную рабочую станцию и микроскоп для препарирования 70% этанолом.

Затем поместите стерилизованные хирургические инструменты, необходимые для процедуры, в рабочую зону. Подготовьте стерильную чашку с диссекционными средами для захвата головы и другую для вскрытия. Раздайте измельченную среду в отдельную чашку для измельчения мозговой ткани.

После обезглавливания и извлечения мозга поместите только что изолированный мозг под препарирующий микроскоп, чтобы визуализировать любезности, следя за тем, чтобы спинная сторона оставалась сухой и высокой. Обезопасьте мозг, вставив кончики щипцов в место пересечения среднего мозга и коры головного мозга. Оказавшись на месте, полностью удалите спинные мозговые оболочки коры головного мозга.

Затем удалите вентральные мозговые оболочки для максимальной чистоты микроглии и ее выхода. Важно полностью удалить всю менингеальную ткань. Отделите кору головного мозга от остальной части мозга.

Обязательно удалите любые остаточные мозговые оболочки коры головного мозга, которые могут присутствовать на вентральной или медиальной стороне коры головного мозга. Удалив менингеальную ткань, поместите кортикальные средства в приготовленную ранее форму для фарша. Работая в шкафу биологической безопасности второго класса, используйте ножницы, чтобы измельчить мозговую ткань.

Переложите измельченную ткань в 15-миллиметровую коническую трубку. Промойте ножницы и форму для фарша одним миллилитром измельчителя каждая, чтобы получить максимальный выход. Соберите и распределите эти полоскания в коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую измельченную салфетку.

Оставьте тканевую суспензию в покое на одну-две минуты, дав измельченной ткани осесть на дне трубки. По истечении этого времени аккуратно извлеките и выбросьте два миллилитра надосадочной жидкости, стараясь не нарушить осевшую измельченную ткань. Добавьте в измельченную салфетку три миллилитра предварительно подогретого МЦМ, а затем с усилием взбейте ткань.

После завершения триера не должно оставаться заметных твердых тканей. Добавьте еще три миллилитра MCM с помощью того же наконечника для дозатора, чтобы собрать остаточный растиранный образец с наконечника. После сбора центрифугируйте измельченную ткань, чтобы гранулировать клетки.

По завершению верните гранулированные клетки в бокс биологической безопасности. Осторожно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость. Аккуратно ресус.

Суспензируйте клеточную гранулу двумя миллилитрами теплого МЦМ, а затем добавьте клеточную резусную суспензию в подготовленную ранее колбу. Инкубируйте клетки в течение 24 часов. Через 24 часа осторожно постучите колбой по ладони, чтобы разрушить остатки ткани.

Проверьте ячейки до и после постукивания, чтобы убедиться, что мусор полностью удален. Далее замените фильтрующий материал на свежий МЦМ и верните колбу в инкубатор. Ежедневно проверяйте клетки для контроля роста и загрязнения.

Примерно через 17-21 день микроглиальные клетки будут готовы к забору, чтобы определить, готовы ли клетки, исследовать их под инвертированным фазово-контрастным микроскопом. Микроглия готова к сбору урожая. Когда они достигают примерно 40% беглости речи, они выглядят как маленькие, яркие сферические клетки, растущие как монослой поверх других.

Чтобы изолировать, микроглию энергично постукивают колбой по лабораторному столу. Это перемешивание помогает отделить микроглию от других глиальных клеток благодаря низким адгезивным свойствам микроглии. Запечатайте крышки колб параформой и переворачивайте смешанные глиальные культуры с помощью неувлажненного ротационного шейкера с регулируемой температурой в течение пяти часов.

По истечении этого времени визуально осмотрите на предмет того, чтобы микроглия оторвалась от поверхности колбы. С помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа микроглия представляет собой яркие сферические свободно плавающие клетки. На дне колбы будет остаточный слой астроцитов и олигодендроцитов.

Затем соберите надосадочную жидкость, содержащую микроглию, в стерильную коническую центрифужную пробирку и небо. Ресус. Суспензируйте микроглиальную гранулу в теплой микроглиальной среде для роста и определите концентрацию клеток с помощью планшета гемоцитометра. Ячейки на 24-луночном планшете на пластиковой или стерильной стеклянной крышке сползают через 24 часа.

Замените фильтрующий материал на свежий теплый MGM, чтобы удалить плавающие элементы и мусор. Этот этап имеет решающее значение для выживания клеток, и для поддержания покоя микроглии клетки микроглии готовы к экспериментам сразу после этого этапа повторного кормления для оценки чистоты микроглии. Клеточные культуры, полученные из микроглии, эндогенно экспрессирующей GFP, окрашивали на макрофагальный антиген IBA one и противоокрашивали dapi.

Для визуализации ядра клетки более 95% клеток продемонстрировали колокализацию GFP IBA one и dpi. После того, как клетки были подвергнуты воздействию ЛПС, микроглия претерпела резкое морфологическое изменение от маленького бифенотипа до амебоидной формы. Иммунофитохимическое окрашивание на Р65 свидетельствует о том, что в нормальных условиях Р65 диффузно локализуется по всей цитоплазме.

В то время как после двухчасового воздействия Pam P 65 иммунореактивность резко сместилась в ядро клетки, что подтвердило, что изолированная микроглия сохранила свою биохимическую иммунофункциональность. Секрецию провоспалительного цитокина TNF альфа определяли после воздействия PAM или LPS. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как изолировать кортикальную микроглию от зеркального новорожденного для достижения наилучших результатов.

Важно соблюдать стерильную технику и тщательно удалять менингеальную ткань из рассеченной корковой области.