Эффективная выборка генетически закодированных биосенсоров в пространстве для проектирования с помощью планирования экспериментов и автоматизации рабочего процесса

Разработка и оптимизация биосенсоров для биотехнологических применений является областью наших исследований. В частности, мы стремимся понять, как оптимизировать и спроектировать биосенсоры за счет модуляции их генетических элементов. Проектные решения, основанные на интуиции, такие как классическая инженерия промоторов и сортировка клеток с флуоресцентной активацией, обычно применяются при определении характеристик и проектировании биосенсоров.

Методики разработки экспериментов еще не получили широкого распространения в проектировании генетических схем. С помощью этого протокола мы стремимся увеличить использование этих типов методов в разработке генетических схем и биосенсоров. Для начала определите теоретический размер библиотеки и рассчитайте количество отдельных вариантов, необходимых для обеспечения охвата библиотеки более чем на 95%.

Рассчитайте необходимый объем обогащенной антибиотиками лизогении отварной среды в соответствии с количеством колоний, которые подлежат скринингу. Откройте программное обеспечение для обработки жидкостей и нажмите «Запустить» рядом с программой перекачки жидкостей MTP. Поместите подготовленную среду в соответствующее положение резервуара.

Затем заполните деку пустыми пластинами для микротитров согласно раскладке. Установите программу на дозирование 200 микролитров среды. Нажмите OK, чтобы подтвердить запуск программы.

Теперь перенесите заполненные лунки микротитровальных пластин на платформу для сбора колоний, а также распечатайте и перенесите квадратные пластины шнека Pseudomonas putida, преобразованные с ДНК библиотеки вариантов плазмид, в платформу для сбора колоний. Используйте устройство для сбора колоний, чтобы инокулировать каждую предварительно заполненную лунку одной колонией из трансформационных пластин. Снова запечатайте привитые пластины и перенесите их в автономный встряхивающий инкубатор.

После инкубации верните выращенные планшеты на платформу для обработки жидкостей и распечатайте. Нажмите «Выполнить» рядом с протоколом добавления глицерина в MTP. Убедитесь, что расположение пластин на экране совпадает с расположением док-станции для работы с жидкостями.

И последовательно нажмите OK, чтобы протокол запустился. После этого запечатайте пластины и кратковременно перемешайте их в автономном встряхивающем инкубаторе со скоростью 800 оборотов в минуту в течение пяти минут. Нанесите штрих-код на пластины и храните при температуре 80 градусов Цельсия до тех пор, пока это не понадобится.

Расчет необходимого объема среды с добавлением антибиотиков для глубокоскважинных блоков. Нажмите «Запустить» рядом с программой перекачки жидкости DWB. Убедитесь, что фильтрующий материал добавлен в правильный резервуар.

Пустые блоки глубоких скважин находятся в правильном положении при планировке и при наличии достаточного запаса наконечников. Установите программу на дозирование 495 микролитров среды. Когда все будет готово, последовательно нажмите OK, чтобы запустить программу.

Теперь загерметизируйте заполненные блоки глубоких колодцев дышащей мембраной и перенесите на временное хранение при температуре 4 градуса Цельсия. Далее нажмите кнопку «Выполнить» рядом с программой инокуляции из размороженного MTP. Убедитесь, что криосклады MTP и заполненные блоки глубоких скважин переносятся на платформу в соответствии с планировкой, а также что загружено достаточное количество наконечников.

Последовательно нажмите OK для инициализации. Когда программа будет завершена, загерметизируйте привитые на ночь блоки глубоких скважин дышащей мембраной. Перенесите их в автономный инкубатор для встряхивания тарелок на 16 часов при температуре 30 градусов Цельсия, 800 оборотах в минуту и влажности 75%.

Запечатайте, смешайте и верните криостоковые микротитровальные пластины в морозильную камеру при температуре 80 градусов Цельсия. Теперь рассчитаем необходимый объем среды с различными концентрациями эффекторов и антибиотиков для ночных глубоких скважинных блоков, подлежащих скринингу. Нажмите «Запустить» рядом с программой перекачки жидкости DWB.

Затем убедитесь, что резервуары с эффекторным наполнителем расположены правильно. Добавляйте пустые блоки глубоких скважин в платформу для работы с жидкостями. Когда будет получено достаточное количество подсказок, последовательно нажмите кнопку «ОК», чтобы запустить протокол для создания глубоких блоков анализа.

После заполнения запечатать блоки глубоких лунок анализа дышащей мембраной. Наполните манипулятор пустыми тарелками. Повторяйте инокуляцию до тех пор, пока все контрольные блоки не будут заполнены.

Далее нажмите кнопку «Выполнить» рядом с программой передачи данных на анализ DWB. После правильной укладки распечатанных пробных глубокоскважинных блоков с эффекторными добавками пересаживают и вскрывают на ночь глубокоскважинные блоки, содержащие выращенную P.putida. Последовательно нажмите кнопку ОК, чтобы запустить протокол.

Когда программа будет завершена, пломба перенесет пробирные планшеты в офлайн-инкубатор. Выбросьте ночные блоки глубоких колодцев после прививки. Затем переведите блоки глубоких колодцев в центрифугу.

Грануляторы при давлении 4000 G в роторе с ледяным управлением при температуре 18 градусов Цельсия в течение пяти минут. После удаления надосадочной жидкости поместите блоки центрифуги на платформу для работы с жидкостями. Рассчитайте объем, умноженный на требуемый PBS, исходя из количества глубоких скважинных блоков, которые необходимо просеять.

Нажмите «Запустить» рядом с анализом, настройте программу ресуспензии PBS DWB и установите объем дозирования на 500 микролитров. Затем убедитесь, что PBS добавлен в нужный резервуар, и расположите центрифугированные пластины в соответствии с планировкой. Нажмите OK, чтобы запустить программу после подтверждения доступности чаевых.

Загерметизируйте и снимите ресуспензионные блоки глубоких скважин с перегружателя жидкости. Проверьте нижнюю сторону пластины, чтобы убедиться, что гранулы полностью суспензированы. Нажмите кнопку «Выполнить» рядом с ячейками для настройки анализа и программой MTP версии PBS.

Затем перевезите ресуспензионные блоки глубоких скважин в манипулятор жидкости в соответствии с планировкой. Загрузите пустые микротитровальные планшеты в соответствии с раскладкой и установите объем дозирования на 200 микролитров, прежде чем нажать OK. Перенесите заполненные микротитровальные пластины в автономный многорежимный считыватель планшетов и измерьте относительную флуоресценцию и OD600.

Автоматизированный скрининг 5 000 вариантов промотора выявил лучших кандидатов, демонстрирующих активацию более чем в 3,6 раза. Значения EC 50 для 100 уникальных вариантов были построены на графике для визуализации распределения чувствительности и выявления надежных кандидатов. Значения EC 50 были вычислены для 226 обогащенных вариантов и ранжированы с помощью преобразования Lin-log для формирования масштабируемой чувствительности библиотеки.

Окончательный дизайн скрининга был построен с использованием дисперсии уровней 1, 0 и 1 из четырех модулей. Профили моделей Transport, Regulator, P-out и Output Ribosome-Binding Site показали, как изменения в уровнях экспрессии четырех модулей нелинейно влияют на EC 50 и коэффициент Хилла. Определение оптимальных комбинаций экспрессии с помощью RBS-Out, демонстрирующее сильное положительное влияние как на чувствительность, так и на наклон.

Глобально оптимизированный вариант биосенсора, включающий в себя идеальные сильные стороны модуля, продемонстрировал повышенную чувствительность и коэффициент Хилла по сравнению с родительской и оптимизированной версиями.