Характеристика сложных систем по постановке эксперимента подхода: Переходный Белок Expression табачными в качестве примера

Общая цель данного эксперимента заключается в создании прогностических моделей для переходной экспрессии белков в листьях растений. Это достигается за счет разработки экспериментального плана для определения наиболее важных параметров переходной экспрессии и количественной оценки их влияния на накопление белка. В качестве второго шага гены клонируются и переносятся в агробактерии, которые затем вводятся в листья, что приводит к временной экспрессии белка.

Затем образцы листьев анализируются с целью определения уровней экспрессии белка. Получены результаты, которые показывают структуру переходных уровней экспрессии белка в листьях разного возраста и для различных условий инкубации на основе дизайна оценки экспериментальной модели. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как один фактор за раз, заключается в том, что взаимодействие между различными параметрами, такими как возраст листа или положение листа, может быть обнаружено и количественно определено.

Метод «один фактор за раз», который часто используется для характеристики влияния определенных факторов на результат эксперимента, является неоптимальным, поскольку отдельные прогоны во время эксперимента будут выровнены, как жемчужины на нитке, что приводит к низкому покрытию проектного пространства. В отличие от планирования экспериментов по стратегии DOE, изменение более чем одного фактора за раз увеличивает охват и, следовательно, точность получаемых моделей. Кроме того, смещение проектного пространства в одном факторе за раз.

Эксперименты также могут не выявить оптимальные рабочие регионы и предсказать неоптимальные решения, в то время как стратегии Министерства энергетики с большей вероятностью определят предпочтительные условия. Эта блок-схема иллюстрирует процесс планирования стратегии DOE. Первым шагом является определение соответствующих факторов и ответов для включения в дизайн.

В данной демонстрации будут измерены уровни экспрессии модельного моноклонального антитела против ВИЧ 2 G 12 и флуоресцентного маркера белка DS красного цвета на основе предыдущих экспериментов. Минимальная обнаруживаемая разница, считающаяся значимой, будет составлять 10 микрограммов на миллилитр для двух G 12 и 20 микрограммов на миллилитр для DS красного. Кроме того, примерные значения расчетного стандартного отклонения системы для двух G 12 и DS красного составят четыре и восемь микрограмм на миллилитр соответственно.

Остальные шаги по планированию этой стратегии DOE здесь обсуждаться не будут, но подробности можно найти в сопроводительной рукописи. Два G 12 и красный DS будут временно экспрессироваться в растениях табака. Чтобы начать процедуру выращивания растений, подготовьте блоки каменной стены размером 10 на 10 на восемь сантиметров, обильно пролив их деионизированной водой для удаления остатков химических веществ.

После этого уравновесьте блоки свежеприготовленным раствором удобрения семян табака, поместив по одному-два семени табака на каждый блок каменной стены, после чего следует короткая промывка удобрением. Будьте осторожны, чтобы не смыть семена, прорастите и выращивайте растения табака в течение 42 дней в теплице в соответствующих условиях. Подготовьте AUM FASS, вырастив культуру с наружным диаметром 600 нанометров 5,0.

Разбавьте культуру водой и двукратной инфильтрационной средой до наружного диаметра 600 нанометров, необходимого для инъекции перед инъекцией. Подтвердите наружный диаметр 600 нанометров атума фазионной суспензии для подготовки листьев к инъекции. Аккуратно поцарапайте эпидермис в месте инъекции наконечником пипетки, чтобы облегчить приток раствора AUM Fasion.

При этом избегайте разрыва листовой пластинки. Держите шприц, содержащий фазионную суспензию AUM, перпендикулярно листовой пластинке, прикасаясь стволом к обрабатываемому межреберному полю, аккуратно надавливайте выпускным отверстием на нижнюю сторону листа. В то же время осторожно надавите на верхнюю сторону листа, чтобы предотвратить смещение или разрыв листовой пластинки.

Аккуратно надавите на поршень шприца. Модное решение AUM проникает в межклеточные пространства внутри листовой пластинки, о чем свидетельствуют более темные, зеленые и влажные обработанные участки. Следите за тем, чтобы шприц оставался перпендикулярным листу во время инъекции.

В противном случае бактериальная суспензия может вырваться наружу под высоким давлением. Повторяйте эту процедуру в нескольких положениях до тех пор, пока все межреберье не будет инфильтрировано aum, aum, fass. Затем продолжайте работу со следующим межреберным полем после инъекции, инкубируйте растения в условиях, определенных DOE, когда инкубационный период завершится.

Начните отбор проб. Стабилизируйте лист с помощью ручного бумажного полотенца и с помощью пробкового заемщика удалите четыре-пять листовых дисков с обработанных межреберных полей в местах и во временное время, указанных DOE. Не удаляйте весь лист с растения во время забора.

Определите массу каждого образца и поместите его в пластиковую реакционную пробирку объемом 1,5 миллилитра с маркировкой с названием и массой образца. Храните образцы при температуре минус 20 градусов Цельсия или минус 80 градусов Цельсия перед количественным определением белка. На этом этапе процесс может быть приостановлен на несколько месяцев, в зависимости от стабильности образца и температуры хранения для извлечения белков из образцов листового диска.

Добавьте три миллилитра экстракционного буфера на миллиграмм массы образца и измельчите листовые диски в реакционной пробирке с помощью электрического пестика до тех пор, пока не останутся крупные фрагменты. Чтобы избежать перегрева образца, помещайте пробирку на лед всякий раз, когда пробирка становится теплой после центрифугирования. Чтобы удалить дисперсные твердые частицы, перенесите надосадочную жидкость в чистую реакционную пробирку диаметром 1,5 миллиметра.

Измерьте DS красную флуоресценцию дважды подряд. В 96 хорошо отработанном считывателе установлены 530 25 нм возбуждения и 590 35 нм эмиссионные фильтры для каждого образца. Усредните флуоресценцию по двум показаниям и трем техническим повторениям и вычтите значение, записанное для пустого регулятора, содержащего ноль микрограммов на миллилитр DS красного.

Также вычтите это значение из язычков стандартных разведений и используйте эти пустые скорректированные значения для линейной регрессии, дающей эталонную кривую. Наклон опорной кривой затем используется для преобразования флуоресценции, измеренной для образцов, в красные концентрации DS. Процедура определения концентрации двух антител G 12 здесь показана не будет, но подробно описана в сопроводительной рукописи.

Программное обеспечение Design Expert используется для анализа и оценки данных в узле анализа. Выберите ответ для анализа и первоначально выберите «Нет» на вкладке преобразования. Перейдите на вкладку «Сводка по посадке», на которой представлена общая информация о факторах, важных для исследуемой системы.

Программное обеспечение предложит исходную модель на основе ее значимости на вкладке модели. Исходная модель предварительно выбирается на основе результатов сводной подгонки. Используйте автоматический режим для редактирования этой модели на вкладке Innova.

При необходимости изучите предложенную модель и включенные в нее факторы. Вручную удалите все факторы со значениями P выше заданного порога или маловероятные на основе механистических соображений, переключившись обратно на вкладку модели, изменив выбор на ручной и исключив соответствующие факторы из модели. Перейдите на вкладку диагностики, чтобы подтвердить качество модели и обнаружить потенциальные выбросы в наборе данных, которые оказывают сильное влияние на модель.

Изучив все вкладки в средстве диагностики, настройте тип преобразования на соответствующей вкладке, если это предлагается диаграммой Кокса, и перезапустите процедуру анализа на вкладке графиков модели. Визуализируйте оцененную модель для ограниченного числа числовых делителей, например трех. Представление поверхности отклика полезно для оценки оптимальных характеристик.

Поверхности ответа, созданные вручную, иллюстрируют только влияние двух факторов на исследуемый ответ. Влияние любого дополнительного фактора на реакцию выявляется путем изменения его значения или уровня в окне инструментов факторов. Кроме того, коэффициенты можно назначить оси графика, щелкнув по ним правой кнопкой мыши в окне инструментов факторов и выбрав нужную ось независимых переменных.

Манипулируйте уровнями факторов и присваивайте их координатам графика с помощью инструмента факторы. Экспортируйте графики с помощью команды экспорт графика в файл на вкладке файл. Используйте числовой подузел в узле оптимизации для численной оптимизации требуемой реакции, в зависимости от факторов модели, к которым, в свою очередь, могут быть применены определенные ограничения на вкладке критериев.

Рассчитывайте и проверяйте численные решения на вкладке «Решения» на основе входных данных, предоставленных на вкладке «Критерии». Экспортируйте эти решения в другое программное обеспечение, например в электронную таблицу, для дальнейшего анализа, раскрывая настройки коэффициентов, связанные с высокими или низкими значениями отклика. Это полезно, если исследуется более трех числовых факторов, а 3D-представление затруднено В этом репрезентативном исследовании.

Стратегия DOE была использована для изучения влияния различных промоторов и пяти простых RS на транзиторную экспрессию ds. Красные факторы, включенные в модель экспрессии переходных процессов, и исследуемые диапазоны показаны в этой таблице. Коэффициенты, выделенные жирным шрифтом, уникальны для этого эксперимента.

Коэффициенты, выделенные курсивом, относятся к другому эксперименту, который будет описан позже. Для всех дискретных числовых коэффициентов были выбраны по крайней мере три уровня, чтобы можно было рассчитать квадратичную базовую модель. Для получения наиболее точных оценок коэффициентов регрессионной модели был выбран оптимальный алгоритм отбора для отбора прогонов DOE.

Дизайн, первоначально предложенный экспертом по дизайну, состоял из 90 прогонов, но FDS был недостаточным для достижения стандартной ошибки прогнозирования в 1%. Оптимальное расширение конструкции до 210 прогонов решило эту проблему и привело к FDS 100% с более равномерной точностью прогнозирования в пространстве проектирования, обозначенном плоской кривой, красные концентрации DS были определены для всех 210 прогонов, а данные были преобразованы log 10. Модельные коэффициенты были выбраны путем автоматического обратного отбора из кубической модели с альфа-уровнем 0,100.

В результате была получена значимая модель с незначительным недостатком соответствия и высокими значениями коэффициентов множественной корреляции. Значение P для всех модельных факторов было меньше 0,05, и, таким образом, никаких дальнейших ручных манипуляций с моделью не требовалось. Модель содержала три факторных взаимодействия, выделенных жирным шрифтом, которые не были частью первоначальной переоценки квадратичной базовой модели графика FDS.

Использование всех факторов, включенных в окончательную модель прогнозирования, показало, что FDS для стандартной ошибки прогнозирования существенно не уменьшилась за счет включения дополнительных трехфакторных взаимодействий. Эксперт по инструментам диагностики качества модели в Design показал, что преобразование данных было полезным, и в модели не было пропущенных факторов, поскольку нормальный график невязок демонстрировал линейное поведение, и в невязках не наблюдалось никакой конкретной закономерности по сравнению с прогнозируемым графиком. Кроме того, на протяжении всего эксперимента не было обнаружено тенденции указывать на скрытую переменную, зависящую от времени.

Вместо этого предсказания модели очень хорошо согласуются с наблюдаемой красной флуоресценцией Диаса, поскольку все точки лежат близко к диагонали. Таким образом, было высказано предположение, что выбранная модель была полезна для прогнозирования переходной экспрессии красного DS красного цвета в несвинцовых табачных листьях, полученных различными комбинациями промоторных пяти основных UTR в течение инкубационного периода после инфильтрации продолжительностью восемь дней, и для иллюстрации последствий неправильного выбора и преобразования факторов также была выбрана искусственная линейная регрессионная модель без преобразования данных. Как ясно видно на рисунке, нормальный график невязок отклоняется от ожидаемого линейного поведения, и на графике невязок по сравнению с предсказанным наблюдается V-образная закономерность, а не случайный разброс.

Кроме того, график сравнения невязок и прогона выделяет два крайних значения. В то время как прогнозы были плохими как для малых, так и для больших значений, отклоняющихся от диагонали, здесь показаны оптимальные поверхности отклика модели для переходной экспрессии красного DS в табачных листьях. Модель предсказывала, что возраст листьев является значимым фактором с более низкими уровнями экспрессии в старых листьях, например, на втором листе на участке А и участке В по сравнению с молодыми листьями, такими как шестой лист на участке С и участке D. Прогрессия накопления красного DS в листьях не была линейной или экспоненциальной, а следовала сигмоидальной кривой в течение восьми дней инкубации после инфильтрации.

Пять основных комбинаций UTR с промотором CAMV 35 SS приводили к более сильной красной экспрессии DS по сравнению с комбинациями с промотором NOS. Несмотря на то, что пять простых UTR также оказывали значительное влияние на правильную экспрессию DS, как показано при сравнении TL и CHS, сила экспрессии зависела от сопутствующего промотора. Прогностическая модель также показала, что определенные пары промоторных пяти основных комбинаций UTR, таких как nas CHS и CAMV 35 SS CHS, приводили к сбалансированным уровням экспрессии, отличающимся менее чем на 30% от определенного соотношения по всем листьям и времени инкубации более двух дней.

Такая сбалансированная экспрессия была бы полезна для экспрессии мультимерных белков с определенной стехиометрией. Подход DOE также был использован для оптимизации условий инкубации и схем сбора урожая для одновременного производства двух сортов G 12 и DS red в табаке. Факторы, влияющие на переходную экспрессию, которые были включены в этот эксперимент, выделены курсивом 600 нанометров и время инкубации.

Была создана прогностическая модель для экспрессии каждого белка у растений в разном возрасте. Молодые листья были собраны через 40 дней после посева, старые листья были собраны через 47 дней после посева. Затем эти четыре модели были оценены и создана консенсусная модель, которая включала каждый фактор, признанный значимым в отдельных моделях.

Впоследствии было подтверждено, что модель консенсуса по-прежнему является хорошим представлением всех исходных наборов данных. Впоследствии консенсусная модель была использована для определения оптимальных температур инкубации и бактериального OD 600 нанометров для обоих белков для прогнозирования концентраций белков во всех листьях и их положении у молодых и старых растений. Интеграция профилей концентраций с данными о биомассе привела к получению абсолютного выхода белка.

Абсолютное количество белка затем коррелировало с соответствующими затратами на последующие этапы, что позволило провести анализ затрат и выгод для обработки каждого листа на возраст растения. Такое же количество DS red и примерно 65% от двух G 12 было обнаружено у молодых растений по сравнению со старыми, несмотря на примерно на 50% меньшую среднюю биомассу, отражающую более высокую экспрессию специфических белков у молодых растений. Это показало, что молодые растения были полезны для переходной экспрессии, потому что белки достигали более высоких концентраций в течение более коротких периодов роста, несмотря на более низкую общую биомассу по сравнению со старыми растениями.

Наконец, было также обнаружено, что обработка всех листьев со старых растений обходится дороже, чем выбрасывание листьев с первого по третий и увеличение количества растений в партии. Следовательно, модели, основанные на DOE, подходят не только для обозначения финального этапа эксперимента, но и для объединения с другими данными для облегчения более сложных аспектов анализа процесса. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как настроить, проводить и анализировать A DOE для исследования переходной экспрессии белка в растениях.