Генерационный и моноклеточный транскриптомический анализ органоидов гепатоцеллюлярной карциномы после медикаментозного лечения

Мы сосредотачиваемся на том, как органоиды ГЦК реагируют на лечение лекарствами и как их трансляционные исследования меняются на работе. Этот протокол полезен для органоидов ГЦК, а также может быть адаптирован к другим органоидным системам опухолевых органоидов. Для начала установите гепатоцеллюлярную карциному или органоиды, полученные пациентами из ГЦК, и подготовьте их к терапевтическому возмущению.

Приготовьте раствор ленватиниба в диметилсульфоксиде, или DMSO, согласно инструкциям производителя. Разведите бульонный раствор в предварительной культурной среде непосредственно перед использованием до заранее определённой рабочей концентрации. Подготовьте достаточно раствора для достижения равных конечных объёмов во всех скважинах, обеспечивая одинаковую концентрацию DMSO в каждой скважине.

Далее добавьте среду, содержащую ленватиниб, на 20 микромолярах вдоль стенки каждой ямы, чтобы не нарушать матричные купола. Включите управление транспортом с той же конечной концентрацией DMSO. Инкубировать органоиды в стандартных условиях культуры в течение заранее определённого периода обработки.

Для процедур, превышающих 72 часа, заменяйте препаратосодержащую среду каждые 48–72 часа, обеспечивая стабильный график замены во всех скважинах. Запишите исходные изображения яркого поля перед обработкой. Получайте изображения с фиксированными интервалами во время лечения, используя одинаковые настройки микроскопа, увеличение и положения поля.

Для морфологической оценки реакции на лечение используйте одинаковые настройки экспозиции, пороги увеличения и анализа для всех изображений. Измеряйте кривую роста площади органоида, вычисляя общую площадь органоидов на каждую скважину или поле в каждой точке времени и нормализуя значения до исходного уровня. Чтобы измерить средний диаметр органоида, определите диаметр отдельных целых органоидов и вычислите среднее значение на одну скважину.

Далее определите количество сохранившихся органоидов, подсчитав морфологически идентифицируемые целостные органоиды, исключая обломки или свернувшиеся фрагменты. Проведите трёхмерный анализ люминесцентной жизнеспособности в конечной точке обработки, если требуется дополнительная оценка объемной жизнеспособности согласно инструкциям производителя. Затем нанесите график кривых роста площади органоидов со временем.

Сравните средний диаметр органоида между группами, обработанными транспортными средствами, и группами, обработанными ленватинибом. Также сравните сохранившееся количество органоидов по группам лечения. Обеспечить использование последовательных графиков визуализации, критериев включения и параметров анализа для обеспечения воспроизводимости.

Выберите органоидные скважины с целостной 3D-морфологией, достаточным материалом для захвата отдельных клеток и отсутствием видимого загрязнения. Записывайте яркополевые изображения каждого выбранного задолго до диссоциации, используя идентичные настройки микроскопа, увеличение и критерии выбора поля. Собирать органоиды в совпадающие временные точки между контрольными и обработанными группами, сохраняя при этом одинаковую плотность покрытия, график обработки и условия замены среды во всех образцах.

Аспирируйте культурную среду полностью из каждой скважины. Промыйте каждую колодцу ледяным PBS, чтобы удалить остатки среды и мусор. Добавьте в каждую скважину по миллилитру раствора для восстановления ледяных клеток и инкубируете на льду 20–30 минут.

Осторожно ставьте пипеты каждые пять-семь минут во время инкубации, чтобы облегчить растворение матрицы. Переместите растворённый материал в предварительно охлаждённые трубы с помощью широкого отвора или наконечника резаной пипетки, чтобы минимизировать прозрачное напряжение. Ферментативная диссоциация переходят только после того, как матрица в значительной степени растворится и останется минимальный видимый остаток геля.

Центрифугировать восстановленную органоидную суспензию при 300 G на пять минут при 4 градусах Цельсия. Аккуратно удалите супернатант, не трогая гранулу. Заново суспендировать гранулу в одном миллилитре фермента для диссоциации рекомбинантных клеток и инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение пяти-десяти минут.

Пипетте мягко каждые две-три минуты, используя широкий наконечник P1000, чтобы способствовать диссоциации. Остановите пищеварение, когда большинство органоидных фрагментов рассеялись на отдельные клетки, и останутся лишь небольшие остаточные кластеры. Затем добавьте четыре миллилитра ледяной сыворотки PBS с 2% плодовой бычьей сыворотки, чтобы остановить пищеварение.

Затем фильтруйте подвеску через сито для ячейки объемом 40 микрометров. Промыйте один раз PBS, чтобы удалить остатки фермента, заполнителей и мусора. Считайте клетки с помощью исключения Trypan Blue.

После обеспечения жизнеспособности клетки 85% или выше регулируйте конечную концентрацию клеток до 700–1 200 клеток на микролитр. Исключайте образцы с избыточным отходом, обильными мертвыми клетками, крупными видимыми заполненными или неполной диссоциацией. Повторяйте фильтрацию перед загрузкой, если присутствуют заполнители.

Контроль процесса и обработанные образцы при одинаковых условиях, включая фермент диссоциации, время пищеварения, частоту пипетирования, метод фильтрации, концентрацию клетки и стратегию загрузки. Наконец, после амплификации библиотеки одной ячейки выполняется секвенирование по одной ячейке. Органоид выжил и расширялся при стандартных трёхмерных условиях культуры с первого по шестой день после восстановления.

В первый день органоиды выглядели как маленькие компактные структуры, а к шестому — увеличились размеры и чётко выраженная морфология. Органоиды, обработанные ленватинибом, были меньше и имели изменённую морфологию по сравнению с контролями, обработанными ДМСО. Количественный анализ показал уменьшение среднего диаметра органоидов после лечения ленватинибом по сравнению с контролем ДМСО.

Этот протокол позволяет изучать изменения состояния клеток, состава клеток и экспрессии генов после лечения. Самая большая задача — сохранение жизнеспособности клеток, поддержание простой обработки единообразным для всех групп. Клеточный анализ по последующей процедуре может проводиться по этой процедуре, включая кластеризацию, анализ дифференциальных генных экспериментов, анализ обогащения путей и вывод по казначейству.