Isolement des bactéries fécales provenant d’échantillons de l’eau par Filtration

Environmental Microbiology

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Overview

Source : Laboratoires du Dr Ian poivre et Dr Charles Gerba - Université de l’Arizona
Démonstration d’auteur : Luisa Ikner

La qualité des eaux destinée à une utilisation dans des milieux agricoles, récréative et domestique est d’une grande importance en raison du risque de flambées de maladies d’origine hydrique. Les agents microbiens impliqués dans ces événements incluent des parasites, bactéries et virus qui sont détachent en grand nombre dans les selles des personnes infectées et des animaux. Transmission aux hôtes nouveaux et sensibles peut alors se produire par voie fécale-orale après ingestion d’eau contaminée. Par conséquent, la capacité de surveiller les sources d’eau pour la présence de microorganismes pathogènes est importante afin d’assurer la santé publique.

En raison de la multiplicité et la variété potentiellement pathogènes fécale-orale qui peuvent être présents dans l’eau et leurs concentrations variables, il est peu pratique et coûteux d’analyser directement pour chacun d’eux sur une base régulière. Par conséquent, les essais microbiologiques pour la surveillance de la qualité de l’eau emploient des bactéries indicatrices coliformes. Coliformes fécaux constituent en partie, la microflore intestinale normale de mammifères à sang chaud, n’est pas pathogènes et est constamment excrétés dans les fèces. Par conséquent, la détection de coliformes dans l’eau signifie qu’un communiqué de selles s’est produite, et que les micro-organismes pathogènes nuisibles peuvent aussi être présents.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Essentiels de la microbiologie environnementale. Isolement des bactéries fécales provenant d’échantillons de l’eau par Filtration. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

La technique de filtration sur membrane est utilisée pour évaluer la qualité microbiologique de l’eau en testant des bactéries fécales indicatrices. Une quantité d’eau (par exemple 100 mL) est passé à travers une membrane spécialisée avec une taille de pore moyenne minimale de 0,45 µm, facilitant la capture des bactéries, car ils sont environ 1 µm en taille. Après filtration, la membrane est soigneusement appliquée à un milieu de culture spécialisés d’agarose et incubée dans les conditions appropriées à la culture des micro-organismes de la cible.

Lorsqu’il est appliqué pour une utilisation dans la surveillance de la qualité de l’eau, filtration sur membrane est idéale pour les sources de faible turbidité comme eau potable, eaux récréatives naturelles telles que les lacs et les réservoirs et piscines. Les eaux riches en particules (par exemple les eaux usées brutes) seront traduira par l’encrassement du filtre ; donc, seulement de petits volumes (par exemple 100 mL) peut être analysé. Filtration sur membrane n’est pas pratique pour les sources d’eau par des bactéries de grand nombre d’arrière-plan (ou non coliformes), qui peuvent augmenter la difficulté d’énumérer les bactéries coliformes cible sur la moyen d’agarose après incubation.

Cette vidéo montre la collection d’échantillons d’eau environnementale et de l’eau potable, la filtration sur membrane des échantillons et l’énumération de plusieurs types de colonies bactériennes fécal indicateur à l’aide de milieux de culture d’agarose spécialisées y compris les coliformes totaux, coliformes fécaux et les entérocoques fécaux. Essais supplémentaires afin de vérifier les colonies présumées sont également indiqués.

Procedure

1. prélèvement d’échantillons et de traitement de l’eau

  1. Recueillir plusieurs échantillons de 1 L eau de la source d’eau de test (p. ex. les fontaines d’eau, piscines, réservoirs, systèmes de distribution d’eau, des eaux usées brutes ou traitées) et le transport sur la glace au laboratoire pour analyse microbienne.
  2. Stériliser ou désinfecter l’ensemble collecteur de filtration membranaire avant utilisation par autoclavage, l’exposition à l’inflammation de rayonnement (2 min) ou éthanol-flamme UV.
  3. Lors du refroidissement de toutes les parties, brancher correctement le collecteur à un flacon pompe à vide et le vide de déchets par des filtration, contenant l’eau de Javel.
  4. Éthanol-flamme stériliser une paire de pinces et avec eux, retirer un filtre à membrane stérile, quadrillées de son emballage. Membranes de 47 mm de diamètre avec une taille de pores de 0,45 µm sont généralement utilisés. Toutefois, autres diamètres et la taille des pores peut être utilisée sous réserve que la taille des pores peut piéger suffisamment les microorganismes de la cible, et au moins 70 % de la zone de filtre se compose de l’espace poral.
  5. Placez le filtre sur le centre de la zone de filtration membranaire du collecteur et placer un entonnoir filtre stérile sur l’unité et le fixer en place.
  6. Mesurer le volume d’eau désiré (par exemple 100 mL) et l’ajouter à l’entonnoir (une marque de 100 mL est visible sur l’entonnoir).
  7. Appliquer un vide partiel [pression différentielle de 34 à 51 kPa (kiloPascals)] afin d’en tirer l’échantillon d’essai à travers le filtre. Total des matières solides en suspension, y compris les bactéries et la décomposition de la matière organique, plus grande que le filtre moyenne taille des pores de 0,45 µm sont pris au piège sur le filtre. Les particules plus petites y compris les virus et solides tels que de petites quantités de matière organique et sels dissous va passer à travers la membrane et dans la fiole à vide poubelle contenant l’eau de Javel.
  8. La suite complète passage de l’échantillon à travers le filtre, rincez l’intérieur de l’entonnoir avec deux ou trois volumes de 20 à 30 mL d’eau stérile.
  9. L’aspirateur hors tension et retirez l’entonnoir de la tubulure après la fermeture du rinçage final.
  10. Avec une pince stérile éthanol-flamme, retirez immédiatement la membrane filtrante de l’appareil et le placer rapidement sur le milieu approprié d’agarose pour le microorganisme cible (le tableau 1 répertorie les conditions de médias et d’incubation de croissance recommandées pour chacun).
  11. Appliquer le filtre de membrane à la surface d’agarose par un mouvement de type à rouleau pour assurer le contact complet de la membrane avec le milieu de croissance et pour éviter le piégeage de bulles d’air.
  12. Remplacer l’entonnoir de filtration utilisé avec une unité stérile entre le traitement de chaque échantillon et éthanol-assainissez le collecteur en acier inoxydable afin de prévenir la contamination croisée.

2. colonie Enumeration

  1. Après la période d’incubation, enlever les plaques de croissance de l’incubateur pour l’énumération.
  2. Idéalement, effectuer les comptages de colonies sous grossissement de faible puissance à l’aide d’une source de lumière froide, blanche.
  3. Coliformes totaux
    1. Des colonies de coliformes totales sont généralement roses à rouge foncé en couleur avec une surface métallique brillant. L’éclat lui-même peut partiellement ou complètement couvrir la colonie. Morphologies atypiques colonies de coliformes totales peuvent être rouge sombre, mucoïde ou nucléée sans reflet.
    2. Les colonies qui sont rose, bleu, blanc ou incolore tout en manquant de brillance sont considérés comme non-coliformes.
  4. Les coliformes fécaux
    1. Les colonies de coliformes les apparaissent dans plusieurs nuances de bleu.
    2. Les colonies de coliformes fécales sont gris à la crème de couleur.
  5. Entérocoques fécaux
    1. Gamme de colonies les entérocoques fécaux du rose au rouge foncé en couleur.

3. colonie vérification

  1. Coliformes totaux
    1. Pour une vérification de la présence-absence, tamponner la membrane toute en utilisant une boucle inoculation stérile. Pour les colonies, il est préférable de vérifier au moins cinq chacun des morphologies typiques et atypiques.
    2. Transvaser la colonie sélectionnée dans un récipient en verre contenant du bouillon lauryl tryptose avec un tube de Durham. Incuber les tubes inoculés à 35±0.5 ° C pendant 48 h. La présence de croissance indicateur de turbidité parallèlement à la production de gaz vérifie la colonie comme un coliforme.
  2. Les coliformes fécaux
    1. Transférer des colonies de couleur bleues aseptiquement dans les récipients en verre contenant stérile milieu EC avec un tube de Durham. Incuber les tubes inoculés à 44,5 ± 0,2 ° C pendant 24 h. La présence de croissance indicateur de turbidité parallèlement à la production de gaz vérifie la colonie comme un coliforme fécal.
  3. Entérocoques fécaux
    1. Grève des colonies caractérisant la morphologie les entérocoques fécaux pour isolement aseptiquement sur cerveau-cœur Infusion Agar (BHIA) et incuber à 35 ± 0,5 ° C pendant 24 à 48 h.
    2. Transférer la croissance d’une colonie isolée sur BHIA sur deux lames de verre préalablement nettoyé.
    3. Ajouter deux à trois gouttes d’eau oxygénée à 3 % de frottis préparés sur les diapositives. L’apparition rapide de bulles indique un résultat de « catalase positive » et l’isolat n’est pas une bactérie streptocoque fécal.
    4. Effectuer une coloration de Gram pour les isolats essais comme « catalase négative » (pas de bulles observées). Les entérocoques fécaux sont Gram-positif, ovoïdes et apparaissent surtout en paires ou en courtes chaînes.
Indicateur bactérienne fécale Les médias recommandées
(Température d’incubation, temps) 1
Coliformes totaux LES Endo Agar (35 ± 5 ° C, 24h)
Milieu M-Endo (35 ± 5 ° C, 24h)
Les coliformes fécaux m-FC moyenne (44,5 ± 0,2 ° C, 24h)
Entérocoques fécaux m Enterococcus Agar (35 ± 0,5 ° C, 48 h)

Le tableau 1. Milieux de culture culture couramment utilisés pour la détection des indicateurs bactériens les dans les échantillons environnementaux
1 tel que recommandé par les Méthodes Standard pour l’examen de l’eau et des eaux usées (American Public Health Association et l’American Water Works Association, 22ème édition, 2012)

Filtration sur membrane et la culture subséquente de bactéries collectés est une technique utile pour évaluer la qualité et la propreté d’une source d’eau.

La qualité des eaux destinée à une utilisation en milieu agricole, loisirs ou domestique est d’une grande importance, étant donné le risque de flambées de maladies d’origine hydrique. Si l’eau est contaminée par les matières fécales des animaux ou des humains, parasites pathogènes, bactéries ou virus peuvent se propager à de nouveaux hôtes lors de leur ingestion. Surveillance des sources d’eau pour ces organismes pathogènes est donc essentiel de s’assurer de la santé publique.

Le nombre et la variété de pathogènes fécale-orale qui peuvent être présentes dans une source d’eau fait il est impossible d’analyser pour chacun indépendamment et de manière régulière. Au lieu de cela, communes tests microbiologiques pour la qualité de l’eau utilisent des bactéries indicatrices coliformes. Pour plus d’informations sur ce processus, voir la vidéo de cette collection sur les bactéries indicatrices.

Cette vidéo va illustrer le processus de filtration sur membrane sur un échantillon d’eau environnement, montrent comment la culture de plusieurs types de bactéries fécales indicateur dont les coliformes totaux, coliformes fécaux et entercocci fécale et décrivent comment vérifier la présence de contamination fécale.

Technique de filtration sur membrane utilise une pression négative pour dessiner des échantillons d’eau à travers un filtre et piège les bactéries. Le filtre est une membrane spécialisée avec une taille moyenne de pore minimal de 0,45 μm qui permet la capture de bactéries, qui sont généralement autour de 1 μm de taille. Après filtration, la membrane est appliquée aux milieux de croissance d’agarose et incubée dans des conditions appropriées à la culture des micro-organismes de la cible.

Cette technique est idéale pour des sources de faible turbidité comme eau potable, les piscines, ou les lacs et les réservoirs. Eau forte teneur de matière particulaire peut entraîner encrassement ou colmatage du filtre, limitant le volume qui peut être traité. En outre, filtration sur membrane n’est pas pratique pour les sources d’eau contenant un grand nombre d’arrière-plan, ou non-coliformes, comme les eaux d’égout brute, car cela peut augmenter la difficulté de l’énumération des coliformes cible sur la culture et de l’incubation.

Une fois les échantillons bactériens ont été piégés dans le filtre, ils peuvent être transférés à des plaques de croissance afin de déterminer les types de bactéries indicatrices présents dans les échantillons d’eau. Placage sur différents types de média sélectionne pour différents types de bactéries et peut permettre une identification rapide.

Après croissance sur plaques spécifiques de culture, plus confirmation des identités de bactéries indicateur est réalisable à l’aide de techniques telles que la cueillette des colonies dans les milieux liquides et en utilisant des tubes de Durham au captage des gaz, qui devraient seulement être produites en présence de coliformes fécaux ou des coliformes totaux. En outre, les entérocoques fécaux présumés peuvent être confirmés par une combinaison d’une coloration de Gram positif, avec un essai de peroxyde d’hydrogène-catalase négative.

Maintenant que nous sommes familiers avec les principes qui sous-tendent la filtration sur membrane d’échantillons d’eau, examinons un comment cette procédure est effectuée.

Pour commencer la procédure, tout d’abord recueillir des échantillons d’eau provenant de sources d’eau test d’intérêt. S’assurer que les échantillons sont prélevés dans des bouteilles de 1 L stériles. Une fois la collection terminée, mettre les échantillons sur la glace et les transportent au laboratoire pour analyse microbienne.

Pour commencer l’analyse, tout d’abord stériliser un collecteur de filtration membranaire. Ensuite, raccorder la tubulure à une pompe à vide et un flacon de déchets de filtration contenant eau de Javel.

L’éthanol pince flamme-stériliser et enlever une membrane quadrillée stérile de l’emballage. Placez le filtre sur le centre de la zone de filtration membranaire du collecteur et placer un entonnoir filtre stérile sur l’unité, puis fixez en place.

Mesurer un volume d’eau d’essai dans l’entonnoir désiré. Appliquer un vide partiel pour dessiner l’échantillon d’essai à travers le filtre. Suspension des matériaux solides, y compris les bactéries et autres matières organiques, supérieure à 0,45 μm sera bloqué sur ou dans le filtre, tandis que les particules plus petites, les virus et de solides dissous passe bien que dans la fiole de déchets contenant du javellisant.

Après que l’échantillon est passé par le filtre, rincez l’intérieur de l’entonnoir avec 25 mL d’eau stérile 3 fois, permettant de traverser le filtre. Lors du rinçage final est terminé, débranchez l’aspirateur et enlever l’entonnoir de la tubulure.

Ensuite, l’éthanol flamme-stériliser pince et retirez immédiatement la membrane filtrante de l’appareil. Placez-la sur la plaque de croissance approprié pour le microorganisme cible à l’aide d’un mouvement de roulis pour assurer un contact complet avec la surface et de ne pas emprisonner de bulles d’air.

Pour le traitement de chaque échantillon supplémentaire, désinfecter le collecteur en acier inoxydable et utiliser un entonnoir stérile pour éviter toute contamination croisée. Enfin, placer les plaques dans un incubateur pour la période d’incubation adéquate.

Après la période d’incubation, enlever les plaques de l’incubateur pour l’énumération. Si possible, effectuer le dénombrement des colonies sous grossissement de faible puissance à l’aide d’une source de lumière blanche froide. Pour déterminer les coliformes totaux, identifier et dénombrer les colonies qui apparaissent en rose à rouge foncé en couleur et ont un éclat de surface métallique, entièrement ou partiellement couvrant la colonie. Des colonies de coliformes totales atypiques peuvent apparaître mucoïde, rouge foncé, ou nucléées sans reflet.

Les colonies qui apparaissent bleu, incolore, blanc ou rose sans reflet sont considérés comme non-coliformes et ne devraient pas figurer dans le dénombrement des coliformes totaux.

Des colonies de coliformes les apparaîtront sous diverses nuances de bleu, et ceux-ci devraient être comptées comme une catégorie distincte. Les colonies de coliformes fécaux-non sont généralement gris à la crème de couleur et doivent également être enregistrés dans une catégorie individuelle. Enfin, les colonies d’entérocoques fécaux seront la gamme du rose au rouge foncé en couleur et devraient être comptées séparément.

Pour vérifier les colonies de coliformes totales, appliquer une boucle inoculer stérilisée et refroidie à une seule colonie d’intérêt. Transvaser la colonie sélectionnée dans un récipient en verre contenant le bouillon lauryl tryptose et un tube de Durham. Ensuite, placez les cultures dans un incubateur. La présence de la turbidité ainsi que la production de gaz capturée par le tube de Durham vérifie la colonie comme un coliformes totaux.

Pour une vérification de coliforme fécale, transférer aseptiquement colonies de couleur bleues dans les récipients en verre contenant du milieu stérile de EC et un tube de Durham. Placer les tubes inoculés dans un incubateur. Après incubation, trouble inocule en conjonction avec gaz production confirment la colonie d’être un coliforme fécal.

Pour confirmer les entérocoques fécaux, aseptiquement transfert présumé des colonies avec la morphologie correcte sur plaques de gélose cœur-cerveau et incuber. Ensuite, transférer la croissance d’une colonie isolée sur BHIA sur deux lames de verre stérile.

Ajouter 2 à 3 gouttes de peroxyde d’hydrogène 3 % à l’un des lames de verre. La production de gaz rapide indique une bactérie catalase positive tels que Citrobacter. Les bactéries entérocoques fécaux sont catalase négative ; par conséquent, aucune propagation n’est observée. Pour les colonies catalase-négatifs qui ne s’affichent pas bouillonnant, effectuer une coloration de Gram. Comme les entérocoques fécaux, ces devraient apparaître Gram positif, ovoïde en forme et être plus souvent groupées en paires ou courtes chaînes.

Pour trouver un de ces bactéries indicatrices à une source d’eau indique la présence d’une contamination. Si plus de 5 % des échantillons sont jugées être contaminés sur une période d’un mois, la source peut être considérée impropre à la consommation humaine.

Filtration sur membrane est couramment utilisée dans un certain nombre d’applications biologiques et micro-organismes indicateurs fécaux peuvent également être détectés par d’autres procédures expérimentales. Certaines de ces applications sont abordés ici.

Filtration sur membrane permet également au virus capture d’échantillons d’eau. Comme les virus seront généralement présents en très faibles quantités, des échantillons d’eau doivent être concentrés afin de les capturer pour l’analyse. Virus capturés peuvent être ensuite libérés les filtres et identifié à l’aide de techniques telles que l’infectivité essais sur culture de cellules ou PCR.

Filtration sur membrane est également utilisée dans la production d’eau ultra-pure pour usage industriel ou de laboratoire. Beaucoup d’industries ont besoin d’eau ultra-pure pour leurs processus opérationnels, et filtration sur membrane peut servir à éliminer les contaminants, y compris les métaux dissous indésirables et les sels de l’eau. Il peut également être utilisé dans le dessalement de l’eau salée pour produire l’eau potable.

Vous avez juste regardé introduction de Jupiter à l’identification des micro-organismes indicateurs dans l’eau par filtration sur membrane. Vous devez maintenant comprendre comment des échantillons d’eau filtre à membrane, comment la culture de plusieurs types de bactéries fécales indicateur de la membrane et comment ces organismes indicateurs confirment. Merci de regarder !

Applications and Summary

Filtration sur membrane est utilisée dans la capture de virus et de la concentration de l’eau. Les virus pathogènes humains portent une charge nette négative dans les solutions aquatiques et sont souvent présents en faibles quantités dans les sources d’eau. Par conséquent, elles doivent être concentrées avant l’analyse. Filtration sur membrane est mais une capture méthode à cet effet et emploie un filtre charge négative. Les échantillons d’eau (par exemple 1 L) d’intérêt sont modifiés avec une solution saline (par exemple. chlorure de magnésium) pour donner une charge positive aux virus, ce qui facilite leur adsorption sur le filtre à membrane HA charge négative car l’eau est filtrée. Une solution d’acide faible concentration sert à rincer la membrane et débarrasser de sels excédentaires. Une faible concentration et volume d’hydroxyde de sodium est ensuite utilisée pour libérer les virus du filtre avant supplémentaire de concentrations et d’analyses (par exemple cellule culture infectiosité et dosages ou PCR quantitative).

Filtration sur membrane est également utilisée dans la production d’eau de grande pureté processus à usage industriel. Beaucoup d’industries ont besoin d’eau ultra-pure pour leurs processus opérationnels. Filtration sur membrane (p. ex. nano-filtration) sert à éliminer les métaux dissous et les sels de l’eau. Filtration sur membrane est également utilisée dans le dessalement de l’eau salée pour produire de l’eau potable.

1. prélèvement d’échantillons et de traitement de l’eau

  1. Recueillir plusieurs échantillons de 1 L eau de la source d’eau de test (p. ex. les fontaines d’eau, piscines, réservoirs, systèmes de distribution d’eau, des eaux usées brutes ou traitées) et le transport sur la glace au laboratoire pour analyse microbienne.
  2. Stériliser ou désinfecter l’ensemble collecteur de filtration membranaire avant utilisation par autoclavage, l’exposition à l’inflammation de rayonnement (2 min) ou éthanol-flamme UV.
  3. Lors du refroidissement de toutes les parties, brancher correctement le collecteur à un flacon pompe à vide et le vide de déchets par des filtration, contenant l’eau de Javel.
  4. Éthanol-flamme stériliser une paire de pinces et avec eux, retirer un filtre à membrane stérile, quadrillées de son emballage. Membranes de 47 mm de diamètre avec une taille de pores de 0,45 µm sont généralement utilisés. Toutefois, autres diamètres et la taille des pores peut être utilisée sous réserve que la taille des pores peut piéger suffisamment les microorganismes de la cible, et au moins 70 % de la zone de filtre se compose de l’espace poral.
  5. Placez le filtre sur le centre de la zone de filtration membranaire du collecteur et placer un entonnoir filtre stérile sur l’unité et le fixer en place.
  6. Mesurer le volume d’eau désiré (par exemple 100 mL) et l’ajouter à l’entonnoir (une marque de 100 mL est visible sur l’entonnoir).
  7. Appliquer un vide partiel [pression différentielle de 34 à 51 kPa (kiloPascals)] afin d’en tirer l’échantillon d’essai à travers le filtre. Total des matières solides en suspension, y compris les bactéries et la décomposition de la matière organique, plus grande que le filtre moyenne taille des pores de 0,45 µm sont pris au piège sur le filtre. Les particules plus petites y compris les virus et solides tels que de petites quantités de matière organique et sels dissous va passer à travers la membrane et dans la fiole à vide poubelle contenant l’eau de Javel.
  8. La suite complète passage de l’échantillon à travers le filtre, rincez l’intérieur de l’entonnoir avec deux ou trois volumes de 20 à 30 mL d’eau stérile.
  9. L’aspirateur hors tension et retirez l’entonnoir de la tubulure après la fermeture du rinçage final.
  10. Avec une pince stérile éthanol-flamme, retirez immédiatement la membrane filtrante de l’appareil et le placer rapidement sur le milieu approprié d’agarose pour le microorganisme cible (le tableau 1 répertorie les conditions de médias et d’incubation de croissance recommandées pour chacun).
  11. Appliquer le filtre de membrane à la surface d’agarose par un mouvement de type à rouleau pour assurer le contact complet de la membrane avec le milieu de croissance et pour éviter le piégeage de bulles d’air.
  12. Remplacer l’entonnoir de filtration utilisé avec une unité stérile entre le traitement de chaque échantillon et éthanol-assainissez le collecteur en acier inoxydable afin de prévenir la contamination croisée.

2. colonie Enumeration

  1. Après la période d’incubation, enlever les plaques de croissance de l’incubateur pour l’énumération.
  2. Idéalement, effectuer les comptages de colonies sous grossissement de faible puissance à l’aide d’une source de lumière froide, blanche.
  3. Coliformes totaux
    1. Des colonies de coliformes totales sont généralement roses à rouge foncé en couleur avec une surface métallique brillant. L’éclat lui-même peut partiellement ou complètement couvrir la colonie. Morphologies atypiques colonies de coliformes totales peuvent être rouge sombre, mucoïde ou nucléée sans reflet.
    2. Les colonies qui sont rose, bleu, blanc ou incolore tout en manquant de brillance sont considérés comme non-coliformes.
  4. Les coliformes fécaux
    1. Les colonies de coliformes les apparaissent dans plusieurs nuances de bleu.
    2. Les colonies de coliformes fécales sont gris à la crème de couleur.
  5. Entérocoques fécaux
    1. Gamme de colonies les entérocoques fécaux du rose au rouge foncé en couleur.

3. colonie vérification

  1. Coliformes totaux
    1. Pour une vérification de la présence-absence, tamponner la membrane toute en utilisant une boucle inoculation stérile. Pour les colonies, il est préférable de vérifier au moins cinq chacun des morphologies typiques et atypiques.
    2. Transvaser la colonie sélectionnée dans un récipient en verre contenant du bouillon lauryl tryptose avec un tube de Durham. Incuber les tubes inoculés à 35±0.5 ° C pendant 48 h. La présence de croissance indicateur de turbidité parallèlement à la production de gaz vérifie la colonie comme un coliforme.
  2. Les coliformes fécaux
    1. Transférer des colonies de couleur bleues aseptiquement dans les récipients en verre contenant stérile milieu EC avec un tube de Durham. Incuber les tubes inoculés à 44,5 ± 0,2 ° C pendant 24 h. La présence de croissance indicateur de turbidité parallèlement à la production de gaz vérifie la colonie comme un coliforme fécal.
  3. Entérocoques fécaux
    1. Grève des colonies caractérisant la morphologie les entérocoques fécaux pour isolement aseptiquement sur cerveau-cœur Infusion Agar (BHIA) et incuber à 35 ± 0,5 ° C pendant 24 à 48 h.
    2. Transférer la croissance d’une colonie isolée sur BHIA sur deux lames de verre préalablement nettoyé.
    3. Ajouter deux à trois gouttes d’eau oxygénée à 3 % de frottis préparés sur les diapositives. L’apparition rapide de bulles indique un résultat de « catalase positive » et l’isolat n’est pas une bactérie streptocoque fécal.
    4. Effectuer une coloration de Gram pour les isolats essais comme « catalase négative » (pas de bulles observées). Les entérocoques fécaux sont Gram-positif, ovoïdes et apparaissent surtout en paires ou en courtes chaînes.
Indicateur bactérienne fécale Les médias recommandées
(Température d’incubation, temps) 1
Coliformes totaux LES Endo Agar (35 ± 5 ° C, 24h)
Milieu M-Endo (35 ± 5 ° C, 24h)
Les coliformes fécaux m-FC moyenne (44,5 ± 0,2 ° C, 24h)
Entérocoques fécaux m Enterococcus Agar (35 ± 0,5 ° C, 48 h)

Le tableau 1. Milieux de culture culture couramment utilisés pour la détection des indicateurs bactériens les dans les échantillons environnementaux
1 tel que recommandé par les Méthodes Standard pour l’examen de l’eau et des eaux usées (American Public Health Association et l’American Water Works Association, 22ème édition, 2012)

Filtration sur membrane et la culture subséquente de bactéries collectés est une technique utile pour évaluer la qualité et la propreté d’une source d’eau.

La qualité des eaux destinée à une utilisation en milieu agricole, loisirs ou domestique est d’une grande importance, étant donné le risque de flambées de maladies d’origine hydrique. Si l’eau est contaminée par les matières fécales des animaux ou des humains, parasites pathogènes, bactéries ou virus peuvent se propager à de nouveaux hôtes lors de leur ingestion. Surveillance des sources d’eau pour ces organismes pathogènes est donc essentiel de s’assurer de la santé publique.

Le nombre et la variété de pathogènes fécale-orale qui peuvent être présentes dans une source d’eau fait il est impossible d’analyser pour chacun indépendamment et de manière régulière. Au lieu de cela, communes tests microbiologiques pour la qualité de l’eau utilisent des bactéries indicatrices coliformes. Pour plus d’informations sur ce processus, voir la vidéo de cette collection sur les bactéries indicatrices.

Cette vidéo va illustrer le processus de filtration sur membrane sur un échantillon d’eau environnement, montrent comment la culture de plusieurs types de bactéries fécales indicateur dont les coliformes totaux, coliformes fécaux et entercocci fécale et décrivent comment vérifier la présence de contamination fécale.

Technique de filtration sur membrane utilise une pression négative pour dessiner des échantillons d’eau à travers un filtre et piège les bactéries. Le filtre est une membrane spécialisée avec une taille moyenne de pore minimal de 0,45 μm qui permet la capture de bactéries, qui sont généralement autour de 1 μm de taille. Après filtration, la membrane est appliquée aux milieux de croissance d’agarose et incubée dans des conditions appropriées à la culture des micro-organismes de la cible.

Cette technique est idéale pour des sources de faible turbidité comme eau potable, les piscines, ou les lacs et les réservoirs. Eau forte teneur de matière particulaire peut entraîner encrassement ou colmatage du filtre, limitant le volume qui peut être traité. En outre, filtration sur membrane n’est pas pratique pour les sources d’eau contenant un grand nombre d’arrière-plan, ou non-coliformes, comme les eaux d’égout brute, car cela peut augmenter la difficulté de l’énumération des coliformes cible sur la culture et de l’incubation.

Une fois les échantillons bactériens ont été piégés dans le filtre, ils peuvent être transférés à des plaques de croissance afin de déterminer les types de bactéries indicatrices présents dans les échantillons d’eau. Placage sur différents types de média sélectionne pour différents types de bactéries et peut permettre une identification rapide.

Après croissance sur plaques spécifiques de culture, plus confirmation des identités de bactéries indicateur est réalisable à l’aide de techniques telles que la cueillette des colonies dans les milieux liquides et en utilisant des tubes de Durham au captage des gaz, qui devraient seulement être produites en présence de coliformes fécaux ou des coliformes totaux. En outre, les entérocoques fécaux présumés peuvent être confirmés par une combinaison d’une coloration de Gram positif, avec un essai de peroxyde d’hydrogène-catalase négative.

Maintenant que nous sommes familiers avec les principes qui sous-tendent la filtration sur membrane d’échantillons d’eau, examinons un comment cette procédure est effectuée.

Pour commencer la procédure, tout d’abord recueillir des échantillons d’eau provenant de sources d’eau test d’intérêt. S’assurer que les échantillons sont prélevés dans des bouteilles de 1 L stériles. Une fois la collection terminée, mettre les échantillons sur la glace et les transportent au laboratoire pour analyse microbienne.

Pour commencer l’analyse, tout d’abord stériliser un collecteur de filtration membranaire. Ensuite, raccorder la tubulure à une pompe à vide et un flacon de déchets de filtration contenant eau de Javel.

L’éthanol pince flamme-stériliser et enlever une membrane quadrillée stérile de l’emballage. Placez le filtre sur le centre de la zone de filtration membranaire du collecteur et placer un entonnoir filtre stérile sur l’unité, puis fixez en place.

Mesurer un volume d’eau d’essai dans l’entonnoir désiré. Appliquer un vide partiel pour dessiner l’échantillon d’essai à travers le filtre. Suspension des matériaux solides, y compris les bactéries et autres matières organiques, supérieure à 0,45 μm sera bloqué sur ou dans le filtre, tandis que les particules plus petites, les virus et de solides dissous passe bien que dans la fiole de déchets contenant du javellisant.

Après que l’échantillon est passé par le filtre, rincez l’intérieur de l’entonnoir avec 25 mL d’eau stérile 3 fois, permettant de traverser le filtre. Lors du rinçage final est terminé, débranchez l’aspirateur et enlever l’entonnoir de la tubulure.

Ensuite, l’éthanol flamme-stériliser pince et retirez immédiatement la membrane filtrante de l’appareil. Placez-la sur la plaque de croissance approprié pour le microorganisme cible à l’aide d’un mouvement de roulis pour assurer un contact complet avec la surface et de ne pas emprisonner de bulles d’air.

Pour le traitement de chaque échantillon supplémentaire, désinfecter le collecteur en acier inoxydable et utiliser un entonnoir stérile pour éviter toute contamination croisée. Enfin, placer les plaques dans un incubateur pour la période d’incubation adéquate.

Après la période d’incubation, enlever les plaques de l’incubateur pour l’énumération. Si possible, effectuer le dénombrement des colonies sous grossissement de faible puissance à l’aide d’une source de lumière blanche froide. Pour déterminer les coliformes totaux, identifier et dénombrer les colonies qui apparaissent en rose à rouge foncé en couleur et ont un éclat de surface métallique, entièrement ou partiellement couvrant la colonie. Des colonies de coliformes totales atypiques peuvent apparaître mucoïde, rouge foncé, ou nucléées sans reflet.

Les colonies qui apparaissent bleu, incolore, blanc ou rose sans reflet sont considérés comme non-coliformes et ne devraient pas figurer dans le dénombrement des coliformes totaux.

Des colonies de coliformes les apparaîtront sous diverses nuances de bleu, et ceux-ci devraient être comptées comme une catégorie distincte. Les colonies de coliformes fécaux-non sont généralement gris à la crème de couleur et doivent également être enregistrés dans une catégorie individuelle. Enfin, les colonies d’entérocoques fécaux seront la gamme du rose au rouge foncé en couleur et devraient être comptées séparément.

Pour vérifier les colonies de coliformes totales, appliquer une boucle inoculer stérilisée et refroidie à une seule colonie d’intérêt. Transvaser la colonie sélectionnée dans un récipient en verre contenant le bouillon lauryl tryptose et un tube de Durham. Ensuite, placez les cultures dans un incubateur. La présence de la turbidité ainsi que la production de gaz capturée par le tube de Durham vérifie la colonie comme un coliformes totaux.

Pour une vérification de coliforme fécale, transférer aseptiquement colonies de couleur bleues dans les récipients en verre contenant du milieu stérile de EC et un tube de Durham. Placer les tubes inoculés dans un incubateur. Après incubation, trouble inocule en conjonction avec gaz production confirment la colonie d’être un coliforme fécal.

Pour confirmer les entérocoques fécaux, aseptiquement transfert présumé des colonies avec la morphologie correcte sur plaques de gélose cœur-cerveau et incuber. Ensuite, transférer la croissance d’une colonie isolée sur BHIA sur deux lames de verre stérile.

Ajouter 2 à 3 gouttes de peroxyde d’hydrogène 3 % à l’un des lames de verre. La production de gaz rapide indique une bactérie catalase positive tels que Citrobacter. Les bactéries entérocoques fécaux sont catalase négative ; par conséquent, aucune propagation n’est observée. Pour les colonies catalase-négatifs qui ne s’affichent pas bouillonnant, effectuer une coloration de Gram. Comme les entérocoques fécaux, ces devraient apparaître Gram positif, ovoïde en forme et être plus souvent groupées en paires ou courtes chaînes.

Pour trouver un de ces bactéries indicatrices à une source d’eau indique la présence d’une contamination. Si plus de 5 % des échantillons sont jugées être contaminés sur une période d’un mois, la source peut être considérée impropre à la consommation humaine.

Filtration sur membrane est couramment utilisée dans un certain nombre d’applications biologiques et micro-organismes indicateurs fécaux peuvent également être détectés par d’autres procédures expérimentales. Certaines de ces applications sont abordés ici.

Filtration sur membrane permet également au virus capture d’échantillons d’eau. Comme les virus seront généralement présents en très faibles quantités, des échantillons d’eau doivent être concentrés afin de les capturer pour l’analyse. Virus capturés peuvent être ensuite libérés les filtres et identifié à l’aide de techniques telles que l’infectivité essais sur culture de cellules ou PCR.

Filtration sur membrane est également utilisée dans la production d’eau ultra-pure pour usage industriel ou de laboratoire. Beaucoup d’industries ont besoin d’eau ultra-pure pour leurs processus opérationnels, et filtration sur membrane peut servir à éliminer les contaminants, y compris les métaux dissous indésirables et les sels de l’eau. Il peut également être utilisé dans le dessalement de l’eau salée pour produire l’eau potable.

Vous avez juste regardé introduction de Jupiter à l’identification des micro-organismes indicateurs dans l’eau par filtration sur membrane. Vous devez maintenant comprendre comment des échantillons d’eau filtre à membrane, comment la culture de plusieurs types de bactéries fécales indicateur de la membrane et comment ces organismes indicateurs confirment. Merci de regarder !

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