Antikörper-Generierung: Herstellung monoklonaler Antikörper mit Hybridomen

Immunology

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Concepts

Quelle: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, und Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Mikrobiologie, Immunologie und Krebsbiologie Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
2 Zentrum für Immunologie, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
3 Institut für Urologie, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
4 Freimaurerkrebszentrum, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Polyklonale Antikörper sind definiert als eine Ansammlung von Antikörpern, die gegen verschiedene antigene Determinanten eines Antigens oder mehrerer Antigene gerichtet sind (1). Während polyklonale Antikörper mächtige Werkzeuge zur Identifizierung biologischer Moleküle sind, gibt es eine wichtige Einschränkung - sie sind nicht in der Lage, zwischen Antigenen zu unterscheiden, die antigene Determinanten teilen. Wenn beispielsweise Rinderserumalbumin verwendet wird, um ein Tier zu immunisieren, reagieren B-Zellen mit unterschiedlicher Oberfläche Ig auf verschiedene antigene Determinanten auf Rinderserumalbumin. Das Ergebnis ist eine Mischung von Antikörpern im Antiserum. Da Rinderserumalbumin einige Epitope mit menschlichem Serumalbumin in evolutionär konservierten Regionen des Proteins teilt, wird dieses Anti-Rinder-Serumalbumin-Antiserum auch mit menschlichem Serumalbumin reagieren. Daher wird dieses Antiserum nicht nützlich sein, um zwischen Rindern und menschlichen Serumalbuminen zu unterscheiden.

Es wurden mehrere Ansätze ergriffen, um die Spezifische Problemaz der polyklonalen Antisera zu überwinden. Eine besteht darin, die unerwünschten Antikörper zu absorbieren, indem das Antiserum durch eine Chromatographiesäule von immobilisierten Antigenen (2) geleitet wird. Diese Methode ist mühsam und oft nicht in der Lage, die unerwünschten Antikörper vollständig zu entfernen. Ein weiterer Ansatz besteht darin, einzelne Antikörper produzierende B-Zellen zu isolieren und in der Kultur zu erweitern. Wie die meisten normalen untransformierten Zellen überleben B-Zellen jedoch nicht in der Langzeitkultur.

Um die Unfähigkeit von B-Zellen zu überwinden, in der Kultur zu überleben, besteht ein Ansatz darin, ein Myelom-B-Zellhybridom vorzubereiten. 1847 entdeckte Henry Bence-Jones, dass Patienten mit multiplem Myelom, einem Lymphtumor, eine große Menge an Antikörpern produzierten (3). B-Zellen bei diesen Patienten sind bösartig geworden und wachsen unkontrolliert. Da die bösartigen B-Zellen von einem einzigen Klon abgeleitet sind, sind sie identisch und produzieren nur einen einzigen Typ von Antikörpern(d. h.einen monoklonalen Antikörper oder mAb). Die meisten dieser Myelomzellen produzieren jedoch Antikörper unbekannter Spezifitäten. 1975 gelang es Cesar Milstein und Georges Kohler durch die Verschmelzung einer Myelomzelle mit einer B-Zelle, ein Hybridom zu produzieren, das in vitro unbegrenzt kultiviert werden kann und eine unbegrenzte Anzahl monoklonaler Antikörper bekannter antigener Spezifität produziert (4). Der Grund für ihren Ansatz ist es, die unsterblichen Eigenschaften der Myelomzelle und der Antikörper, die Eigenschaften der B-Zelle produzieren, zu kombinieren. Ihre Technik revolutionierte die Antikörperproduktion und bietet ein leistungsfähiges Mittel zur Identifizierung und Reinigung biologischer Moleküle mit monoklonalen Antikörpern.

Im Allgemeinen dauert die Herstellung eines monoklonalen Antikörpers mehrere Monate. Das allgemeine Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

  1. Immunisierung und Screening von Antikörper-Titer
  2. Fusion von Antikörper produzierenden B-Zellen und Myelomzellen
  3. Selektives Wachstum des Hybridoms
  4. Screening der Hybridome zur Herstellung des gewünschten monoklonalen Antikörpers
  5. Klonen durch Begrenzung der Verdünnung - ein Prozess, bei dem Zellen zu einer Konzentration verdünnt werden, um statistisch zuzulassen, dass weniger als 1 Zelle in die Brunnen einer 96-Well-Platte aufgenommen wird. Einige Brunnen werden mit 0 Zellen enden und einige haben 1 Zelle. Die Brunnen mit 1 Zelle werden schließlich zu einer monoklonalen Population von Zellen heranwachsen.
  6. Wachstum des Hybridoms und Herstellung monoklonaler Antikörper

Dieses Protokoll konzentriert sich auf den letzten Schritt - das Wachstum des Hybridoms und die Herstellung des monoklonalen Antikörpers. Der Antikörper wird aus dem Kulturüberstand durch Ammoniumsulfat-Fällung (oft als Aussalzung bezeichnet) gereinigt - eine häufig verwendete Methode, um Proteine aus einer Lösung zu entfernen. Proteine in Lösung bilden Wasserstoffbindungen, zusammen mit anderen hydrophilen Wechselwirkungen, mit Wasser durch ihre exponierten polaren und ionischen Gruppen. Wenn Konzentrationen von kleinen, hochgeladenen Ionen (wie Ammonium oder Sulfat) zugesetzt werden, konkurrieren diese Gruppen mit den Proteinen um die Bindung an Wasser. Dadurch werden die Wassermoleküle aus dem Protein entfernt und seine Löslichkeit verringert, was zu einer Ausfällung des Proteins führt.

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JoVE Science Education Database. Immunologie. Antikörper-Generierung: Herstellung monoklonaler Antikörper mit Hybridomen. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Procedure

Hinweis: Die Sterile Zellkulturtechnik sollte beim sterilen Umgang mit den Hybridomzellen und den Medien (z. B. in einem Biosicherheitsschrank) bis zu den Antikörperreinigungsschritten aufrechterhalten werden.

1. Auftauen gefrorener Hybridomzellen

  1. Inkubieren Sie die Durchstechflasche mit den gefrorenen Hybridomzellen in einem 37°C Wasserbad, bis sie gerade aufgetaut ist (ca. 2 Minuten).
  2. Fügen Sie die aufgetauten Zellen zu einem 15 ml konischen Rohr hinzu, das 10 ml vollständiges RPMI enthält (RPMI ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 100 U/ml Penicillin, 100 g/mL Streptomycin, 1mM Natriumpyruvat, 1x nicht essentielle Säuren Aminosäuren, 50 m 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES).
  3. Zentrifuge für 5 min bei 1200 U/min, um alle kontaminierenden Gefriermedien auszuwaschen.
  4. Nach der Zentrifugation den flüssigen Überstand entsorgen und das Zellpellet in 5 ml frischem, vollständigem RPMI wieder aufhängen. Fügen Sie dann die Zellen zu einem T75-Gewebekulturkolben hinzu, der 15 ml vollständiges RPMI enthält (endletztes Volumen von RPMI beträgt 20 ml).
  5. Wachsen Sie die Zellen in einem Standard-Inkubator bei 37°C mit 5%CO2. Zellen sind in der Kultur nicht haftende.

2. Hybridom-Erweiterung

  1. Lassen Sie die Zellen für etwa 3 Tage zu erweitern, bis der Kolben ist 80% konfluent.
    Hinweis: Diese Zeit kann je nach Startzahl der Zellen sowie inhärenten Unterschieden in den Wachstumsraten verschiedener Zellen variieren. Es ist wichtig, dass sich die Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase befinden.
  2. Sobald der Anfangskolben die Koninfluenza von 80 % erreicht hat, entfernen Sie die Zellen aus diesem anfänglichen T75-Kolben, legen Sie sie in ein konisches Zentrifugenrohr und drehen Sie (1200 U/min für 5 min), um die Zellen zu pellet.
  3. Setzen Sie die Zellen in 6 ml vollständiger RPMI wieder auf, und verteilen Sie die Zellsuspension dann in drei neue T75-Kolben (2 ml/Kolben mit 18 ml RPMI). Inkubieren Sie diese drei T75-Kolben bei 37°C mit 5%CO2, bis sie zu 80% konfluent sind (Dies sollte ca. 3 Tage dauern).

3. Antikörperproduktion in serumfreiem Medium

Hinweis: An diesem Punkt sind die Zellen bereit, ihr Wachstum in einem serumfreien Medium fortzusetzen, das für das Wachstum von Hybridom-Zelllinien entwickelt wurde. In diesem Protokoll verwenden wir das gebrauchsfertige, handelsübliche HB Basal Liquid Medium, das das HB101 Supplement Produkt enthält.

  1. Die Zellen aus jedem der drei T75-Kolben (bei einer Konfluenz von 80 %) werden gesammelt und zentrifugiert (1200 U/min für 5 min).
  2. Das Zellpellet aus jedem T75-Kolben wird in 10 ml ergänztem HB101-Serummedium resuspendiert und dann zu zwei T225-Flaschen hinzugefügt, die HB101-Serum-freies Medium ergänzten (d. h. 5 ml Zellsuspension in jedem von 6 Kolben mit einem Inhalt von 220-240 ml HB101 in jedem Kolben).
  3. Die Zellen in T225-Flaschen und HB101-Medien bei 37 °C mit 5%CO2 für drei Wochen weiter anbauen, oder bis die Zellen zu sterben beginnen. Die Zellen produzieren mAb während dieser 3 Wochen und verschwiegen es in das Kulturmedium. Sobald die Zellen zu sterben beginnen, produzieren sie kein mAb mehr.

4. Antikörperreinigung - Tag 1

Hinweis: An dieser Stelle muss die Sterilität nicht aufrechterhalten werden, so dass ein steriler Umgang mit den Medien (z. B. in einem Biosicherheitsschrank) nicht erforderlich ist. Darüber hinaus werden Hybridome nicht als "BSL2-Level"-Agent betrachtet.

  1. Gießen Sie Medien aus den Kolben in Rohre für einen festen Winkelrotor. Drehen Sie die Rohre in einer Zentrifuge mit einem festen Winkelrotor bei 10.000 U/min für 8 Minuten. Dieser Schritt wurde entwickelt, um die zellulären Trümmer aus dem Kulturüberstand zu entfernen.
    Hinweis: Die Rohrgrößen können je nach verwendeter Rotor variieren. Wichtig ist, das gleiche Volumen in den Rohren zu haben, um sicherzustellen, dass der Rotor vor der Zentrifugation richtig ausbalanciert ist. Es ist wahrscheinlich, dass das gesamte Volumen der Medien nicht gleichzeitig in die Zentrifuge passt. Die restlichen Medien werden später (Schritt 4.5) mit den gleichen Rohren zentrifugiert.
  2. Bereiten Sie einen 2L Plastikbecher mit einer Rührstange in einem Eimer, der von Eis umgeben ist. Auf eine Rührplatte legen.
  3. Befestigen Sie eine 500 ml Filterplatte an einer 1L-Flasche. Befestigen Sie die Flaschen-Top-Filtereinheit, um Vakuum über geeignete Schläuche zu beherbergen.
  4. Gießen Sie den Überstand aus Schritt 4.1 (der noch das von den Hybridomzellen produzierte mAb enthält) in die Filteroberseite.
  5. Verwenden Sie weiterhin den gleichen Satz von Rohren, um Zellablagerungen aus den Medien zu pellet (das Pellet wird weiter zu bauen). Warten Sie, bis das Vakuum ausgeführt wird, bis die Filteroberseite voll ist und eine weitere Charge über den Überstand bereit ist, hineinzugießen. Lassen Sie den Filter nicht austrocknen oder die Filterung wird sehr langsam.
  6. Wenn die 1L-Flasche fast voll ist, entfernen Sie die Filterplatte und gießen Sie Überstand in 2L Becher in Schritt 4.2 vorbereitet. Schließen Sie das Filteroberteil wieder an. Verfolgen Sie die Lautstärke.
  7. Wiederholen Sie die Zentrifugations- und Filtrationsschritte, bis alle Medien verarbeitet sind.
  8. Messen Sie 295g Ammoniumsulfat pro 1L gefilterten Überstand gesammelt. Während des Rührens, langsam fügen Sie das Ammoniumsulfat dem Überstand in den nächsten paar Stunden (ca. 25 g alle 15 Minuten) langsam, um eine lokalisierte hohe Konzentration von Ammoniumsulfatsalz zu verhindern, die unerwünschte Proteine zum Niederschlag führen kann.
  9. Nachdem das gesamte Ammoniumsulfat zugegeben ist, den Becher mit Folie bedecken und mit der Rührplatte auf 4°C (z.B. begehbarer Kühlschrank oder Kühlraum) bewegen. Über Nacht umrühren. Um das Salz zu löslich zu machen, ist ein ständiges Rühren erforderlich, aber ein längeres Rühren kann zu einer Denaturierung der Proteine in der Lösung an der Oberflächen-/Luftschnittstelle führen.
  10. Waschen Sie die Rohre mit dem Festwinkelrotor.

5. Antikörperreinigung - Tag 2

  1. Gießen Sie das Ammoniumsulfat, das Überstand aus dem 2L-Becherglas enthält, in Rohre für einen festen Winkelrotor. Drehen Sie in Zentrifuge mit Festwinkelrotor bei 6500 U/min für 20 Minuten ohne Bremse.
  2. Vakuum aspirat den Überstand, achten Darauf, nicht das Pellet zu saugen, wie es weich sein wird. Verwenden Sie weiterhin den gleichen Satz von Rohren, um Pellet aus dem Ammoniumsulfat zu sammeln, das Überstand enthält.
  3. Nach der letzten Aspiration jedes Pellet (das Antikörper enthält) in 1 ml PBS wieder aussetzen.
  4. Entfernen Sie das Ammoniumsulfat aus der gefällten mAb-Lösung durch Dialyse gegen große Mengen pbS. Dazu zunächst ca. 1 Zoll Dialyseschlauch (z.B. Membra-Cel MD25-14 MWCO 12.000-14.000 Dalton Cut-off Cellulose Dialyseschläuche) für jeden ml mAb-Lösung schneiden. Befeuchten Sie den Schlauch mit dH2O. Binden Sie einen Knoten an einem Ende des Schlauches und füllen Sie ihn mit dH2O, um zu überprüfen, ob der Knoten nicht austritt. Leer dH2O aus dem Schlauch.
  5. Pipette PBS/Antikörperlösung in den Schlauch. Spülen Sie die Tuben mit einem zusätzlichen 0,25 ml PBS, und übertragen Sie auf die Schläuche.
  6. Sichern Sie die Oberseite des Schlauches so nah wie möglich an der Lösung mit einem orangefarbenen Dialyseclip.
  7. Kleben Sie die Oberseite des Schlauches an die Außenoberseite eines 4L Bechers. Lassen Sie den gefüllten Teil des Schlauches in den Becher hängen. Füllen Sie den Becher mit PBS und fügen Sie eine Rührstange hinzu.
  8. Über Nacht für 8 Stunden bei 4°C rühren.
  9. Ersetzen Sie die PBS im Becher durch frische PBS und rühren Sie für 8 Stunden zwei weitere Male.
  10. Den Antikörper aus dem Schlauch in 15- oder 50-ml-Konustuben übertragen. Zentrifuge für 5 Minuten bei 1200 U/min, um eventuelle Niederschlagserscheinungen zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand auf ein frisches Rohr.
  11. Verdünnen Sie ein Aliquot von Antikörper 1:20 mit PBS (5 l Antikörper + 95 l PBS). Quantitieren Sie die Antikörperkonzentration mit einem Spektralphotometer (leer mit PBS) bei 280 nm. Verwenden Sie einen Aussterbekoeffizienten () von 1,43. Die Konzentration wird als

  12. Aliquot den Antikörper in Schraubverschlussfläschchen und lagern bei -80°C.

Antikörper sind ein leistungsfähiges Werkzeug für Forschung und Diagnose, was bedeutet, dass es oft notwendig ist, sie in großen Mengen herzustellen.

Der erste Schritt zur Erzeugung von Antikörpern besteht darin, das Antigen von Interesse in ein Wirtstier zu injizieren. Das Antigen aktiviert die B-Zellen des Wirts, die dann Antikörper produzieren und freisetzen, die spezifisch für dieses Antigen sind. Anschließend wird das Antisera des Wirtstiers regelmäßig auf das Vorhandensein des Zielantikörpers unter Verwendung von ELISA oder einer anderen Detektionsmethode überprüft. Sobald es entdeckt wird, wird die Milz des Wirtstiers, die die B-Zellen enthält, entfernt. Wenn nun alle B-Zellen aus der Milz isoliert sind, sollte dies eine Population umfassen, die Antikörper gegen das Antigen von Interesse absondert. Wir bezeichnen diese Population als polyklonal, da jede Zelle wahrscheinlich an ein anderes Epitop des Antigens gebunden ist und daher ihren eigenen individuellen und einzigartigen Antikörper erzeugt hat.

Um monoklonale Antikörper zu erzeugen, müssen Antikörper, die angehoben werden, um ein bestimmtes Epitop zu erkennen, die einzelne B-Zelle, die den gewünschten Antikörper produziert, zunächst isoliert und kultiviert werden. Leider überleben B-Zellen in der Kultur nicht gut. Um diese Hürde zu überwinden, verschmelzen Wissenschaftler B-Zellen mit unsterbsamen Myelomzellen, was zu Hybridomen führt. Diese Zellen werden dann in einem selektiven Medium angebaut, das nur die Hybridome wachsen und Antikörper freisetzen lässt. Auch hier wird das Medium mit einer Methode wie ELISA für den gewünschten Antikörper gescreent. Sobald es entdeckt wird, werden die Hybridome über einen Prozess geklont, der als Limiting-Verdünnung bezeichnet wird, eine serielle Verdünnung der Übergeordnetenkultur, die dazu führen sollte, dass einzelne Zellen in die Brunnen einer Siebplatte gesät werden. Dies ermöglicht das Wachstum von Hybridomen aus einer einzigen übergeordneten Zelle, wodurch eine monoklonale Zelllinie entsagt wird, die nur den gewünschten Antikörper freisetzt. Diese monoklonalen Linien können in Gewebekulturkolben erweitert werden, um große Mengen monoklonaler Antikörper zu produzieren. Danach, wenn die Zellen absterben, können die Antikörper aus dem Medium mit Ammoniumsulfat ausgefällt werden. Normalerweise interagieren Antikörper in Lösung durch hydrophile Wechselwirkungen mit Wasser. Ammonium und Sulfat sind jedoch hochgeladene Ionen, die die Wassermoleküle von den Antikörpern trennen, wodurch die Löslichkeit der Antikörper verringert wird und sie ausfallen.

Überprüfen Sie zunächst die Materialliste, und bereiten Sie zunächst alle Medien, Verbrauchsmaterialien und Arbeitsflächen für das Protokoll vor.

Dann schalten Sie ein Wasserbad ein und stellen Sie es auf 37 Grad Celsius. Als nächstes fügen Sie 10 Milliliter komplettes RPMI zu einem 15-Milliliter konischen Rohr und 15 Milliliter vollständiger RPMI zu einem T75-Zellkulturkolben hinzu und legen sie beiseite. Entfernen Sie mit Vorsicht und dem Tragen der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung die gefrorene Durchstechflasche, die Hybridomzellen enthält, aus der Flüssigkeitsstickstofflagerung. Um den Druck in der Durchstechflasche loszulassen, lösen Sie die Kappe leicht. Jetzt bebrüten Sie sorgfältig die Durchstechflasche im Wasserbad, um sicherzustellen, dass die Kappe über der Wasseroberfläche bleibt, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination zu minimieren. Wenn die Zellen fast aufgetaut sind, was in der Regel etwa zwei Minuten dauert, bewegen Sie die Durchstechflasche zur Gewebekulturhaube.

Wischen Sie dann die Außenseite der Durchstechflasche mit 70% Ethanol ab, bevor Sie die Kappe entfernen. Übertragen Sie die Zellen mit einer sterilen Pipette in das konische Rohr, das 10 Milliliter komplettes RPMI-Medium enthält. Zentrifugieren Sie das Rohr dann für fünf Minuten bei 1200 U/min. Nach der Zentrifugation das Rohr zurück zur Gewebehaube bewegen und die Außenseite des Rohres mit Ethanol abwischen. Ohne das Pellet zu stören, entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie dann fünf Milliliter frisches komplettes RPMI-Medium und sanfte Pipette nach oben und unten hinzu, um sie wieder aufzuhängen. Als nächstes übertragen Sie die Zellen in den T75-Zellkulturkolben und legen Sie den Kolben in einen 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Lassen Sie die Zellen etwa 80% Konfluenz erreichen, was in der Regel etwa drei Tage dauert. Beachten Sie, dass Hybridomzellen nicht haftende sind und im Medium suspendiert wachsen. Die Zeit bis zur Erreichung einer ausreichenden Konfluenz kann je nach der Startzahl der lebenden Zellen und der Art der verwendeten Hybridomzelle variieren.

Sobald die Zellen ausreichend konfluent sind, verwenden Sie eine sterile 25-Milliliter-Pipette, um sie aus dem Kulturkolben in ein konisches Zentrifugenrohr zu übertragen. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 1200 U/min für fünf Minuten. Während sich die Zellen in der Zentrifuge befinden, fügen Sie 18 Milliliter vollständigen RPMI in jede der drei neuen T75-Zellkulturkolben ein und legen Sie diese beiseite. Nach der Zentrifugation den Überstand entfernen und das Zellpellet vorsichtig in sechs Millilitern kompletten RPMI wieder aufhängen. Fügen Sie als Nächstes zwei Milliliter der Zellsuspension in jeden der drei neuen Zellkulturkolben ein. Schließlich legen Sie die Kolben in einen Inkubator eingestellt 5% Kohlendioxid und 37 Grad Celsius und inkubieren, bis die Kolben sind etwa 80% konfluent, etwa drei Tage.

An dieser Stelle sind die Zellen bereit, ihr Wachstum in dem serumfreien Medium für Hybridom-Zelllinien fortzusetzen, wie z. B. kommerziell erhältliches HB Basal Liquid Medium, das die HB101-Ergänzung enthält. Übertragen Sie die Zellen aus jedem Zellkulturkolben in konische Zentrifugenröhren und pellet die Zellen dann fünf Minuten lang durch Zentrifugation bei 1200 U/min. Fügen Sie nun 230 Milliliter ergänztes HB101-Serum-freies Medium in jeweils sechs 225-Zentimeter-Quadrat-Zellkulturkolben ein und legen Sie sie beiseite. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie jedes Pellet in 10 Milliliter nupzierten HB101 Medium. Dann, in jedem Zellkulturkolben, fügen Sie fünf Milliliter der Zellsuspension hinzu. Legen Sie die Kolben in den 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius und weiter die Zellen für etwa drei Wochen wachsen. Während dieser Zeit produzieren und geben die Zellen den monoklonalen Antikörper von Interesse in das Kulturmedium frei und der Antikörper wird bereit für die Reinigung sein, wenn die Zellen zu sterben beginnen.

Um den zellulären Schmutz aus den antikörperhaltigen Kulturmedien zu entfernen, gießen Sie den Inhalt der Kulturkolben in Rohre für einen festen Winkelrotor. Legen Sie die Rohre in den Rotor und stellen Sie sicher, dass sie vor der Zentrifugation richtig ausbalanciert sind. Drehen Sie die Rohre bei 10.000 U/min für acht Minuten. Während die Proben zentrifugieren, legen Sie einen Zweiliter-Plastikbecher mit Rührstange in einen Eiskübel und legen Sie den Eiskübel dann auf eine Rührplatte.

Als nächstes befestigen Sie eine 500-Milliliter-Filterplatte an einer Ein-Liter-Flasche. Befestigen Sie diese Flaschen-Top-Filtereinheit mit den entsprechenden Schläuchen an einem Hausvakuum. Dann gießen Sie den Überstand, der den Antikörper enthält, in die Filteroberseite. Zentrifugieren Sie die verbleibenden Medien, um die Zellablagerungen vom antikörperhaltigen Überstand zu trennen. Wenn die Filterplatte voll von Überstand ist, starten Sie das Vakuum. Wenn die Ein-Liter-Sammelflasche dann fast voll ist, entfernen Sie die Filterplatte und gießen Sie den gefilterten Überstand in den Zweiliter-Becher auf Eis. Wiederholen Sie die Filtrationsschritte, bis der gesamte Überstand verarbeitet ist.

Wenn die gesamte Probe verarbeitet ist, wiegen Sie 295 Gramm Ammoniumsulfat pro Liter gefilterten Überstands. Beginnen Sie die Rührplatte und fügen Sie das Ammoniumsulfat in den nächsten Stunden langsam dem Überstand hinzu. Dies verhindert eine lokalisierte hohe Konzentration von Ammoniumsulfatsalz, die unerwünschte Proteine ausbrechen lassen kann. Nachdem das gesamte Ammoniumsulfat zugegeben ist, bedecken Sie den Becher mit Folie und bewegen Sie es zusammen mit der Rührplatte in einen Kühlraum bei vier Grad Celsius und stellen Sie ihn so ein, dass er die Antikörperlösung über Nacht rührt.

Am nächsten Morgen die Ammoniumsulfat-haltige Antikörperlösung aus dem Zweiliterbecher in saubere Rohre für den Festwinkelrotor gießen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 6500 U/min für 20 Minuten ohne Pause, um den Antikörper an der Unterseite der Rohre zu pellet. Als nächstes, Vakuum aspirat den Überstand, mit Vorsicht nicht das weiche Pellet zu saugen. Verwenden Sie weiterhin den gleichen Satz von Rohren, um den pelletierten Antikörper aus dem Rest des Ammoniumsulfat-haltigen Überstandes zu sammeln. Nach der letzten Aspiration jedes Antikörperpellet in etwa einem Milliliter PBS wieder aussetzen.

Um das Ammoniumsulfat aus der Antikörperlösung zu entfernen, schneiden Sie zunächst etwa einen Zoll Dialyseschlauch für jeden Milliliter Antikörperlösung. Als nächstes wischen Sie die Schläuche mit destilliertem Wasser ab und binden Sie einen Knoten an einem Ende des Schlauches. Füllen Sie die Schläuche mit destilliertem Wasser, um die Leckage aus dem Knoten zu überprüfen. Wenn es nach ein paar Minuten keine Leckage gibt, entleeren Sie das Wasser aus dem Schlauch.

Als nächstes pipette die Antikörperlösung in den Schlauch. Um so viel Antikörper wie möglich zurückzugewinnen, spülen Sie die Schläuche mit zusätzlichen 0,25 MilliliterPBS ab und übertragen Sie diese auch auf die Schläuche. Sichern Sie die Oberseite des Schlauches so nah wie möglich an der Lösung mit einem Dialyseclip. Dann kleben Sie die Oberseite des Schlauches an die Außenoberseite eines Vierliter-Bechers mit dem gefüllten Teil des Schlauches, der in den Becher hängt. Nun nehmen Sie das Becherglas in den vier Grad Celsius kalten Raum und legen Sie es auf eine Rührplatte. Füllen Sie den Becher oben mit PBS und fügen Sie eine Rührstange hinzu. Lassen Sie die Röhre und die Lösung über Nacht für etwa acht Stunden rühren. Am nächsten Morgen die PBS im Becher durch frische PBS ersetzen und dann den Becher für etwa acht Stunden wieder rühren lassen. Später am Abend wiederholen Sie den Vorgang ein letztes Mal. Am Morgen das Dialyserohr öffnen und dann die Antikörperlösung aus den Schläuchen in 15-Milliliter Konusröhren übertragen. Um alle Niederschlagsmittel zu entfernen, die sich während der Dialyse gebildet haben könnten, zentrieren Sie die Rohre für fünf Minuten bei 1200 U/min. Schließlich übertragen Sie den Überstand auf frische Schläuche.

Um die Antikörperkonzentration zu quantifizieren, machen Sie zunächst eine 20-fache Verdünnung, indem Sie fünf Mikroliter aus einem Antikörper, der aliquot zu 95 Mikroliter PBS hinzufügt, hinzufügen. Dann pipette den verdünnten Antikörper in eine Küvette und verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Konzentration bei 280 Nanometern aufzuzeichnen. Berechnen Sie als Nächstes die Antikörperkonzentration mit der gezeigten Formel. Schließlich beschriften Sie Schraubverschlussfläschchen mit dem Antikörpernamen, der Konzentration, dem Herstellungsdatum und gegebenenfalls der Chargennummer und dem Experimentiernamen, und aliquotieren Sie dann den Antikörper in die beschrifteten Schraubverschlussfläschchen. Diese können bis zum Bedarf bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.

Beispielerträge mit der 120G8 Anti-Maus-CD317 oder PDCA-1 Hybridom-Linie reichten zwischen 44 und 99,6 Milligramm, was in der Regel ergibt, im Durchschnitt 67,3 Milligramm Menge. Es ist wichtig zu beachten, dass jeder Produktionslauf mit der gleichen Hybridom-Zelllinie in der Menge an monoklonalen Antikörpern, die am Ende verfügbar sind, leicht unterschiedlich sein kann.

Results

Mit diesem Protokoll haben wir die folgenden Ergebnisse mit verschiedenen Hybridomen erzielt:

Hybridom: RB6-BC5 (Rattenanti-Maus Ly6C/Ly6G (Gr1) IgG2b, mAb)
OD280 - 1.103
(1.103/1.43) (20) = 15,42 mg/ml

Hybridom: GK1.5 (Rattenanti-Maus-CD4-IgG2b, mAb)
OD280 - 0,485
(0.485/1.43) (20) = 6,78 mg/ml

Hybridom: 2,43 (Rattenanti-Maus-CD8-IgG2b, mAb)
OD280 - 0.209
(0.209/1.43) (20) = 2,92 mg/ml

Dies sind alles Beispielergebnisse, und es ist wichtig zu beachten, dass jeder Produktionslauf mit dem gleichen Hybridom in der Menge an mAb, die am Ende verfügbar ist, leicht unterschiedlich sein kann.

Applications and Summary

Das oben beschriebene Verfahren ist eine einfache, geradlinige Möglichkeit, monoklonale Antikörper aus Hybridom-Kulturüberstand zu reinigen. Es ist jedoch wichtig, sich daran zu erinnern, dass das Ammoniumsulfat andere Proteine auslöst, die in der Kultur überstand sein können. Folglich handelt es sich bei den aus den Absorptionsmessungen ermittelten Antikörperkonzentrationen um Schätzungen. Der Benutzer kann die Reinheit der dialysierten Probe beurteilen, indem er eine kleine Menge auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel ausführt. Das von einem Hybridom erzeugte mAb, das nach dieser Methode gereinigt wurde, kann auf verschiedene Weise eingesetzt werden. Die oben beschriebenen RB6-BC5, GK1.5 und 2.43 mAb werden häufig für die In-vivo-Erschöpfung von Neutrophilen, CD4-T-Zellen bzw. CD8-T-Zellen bei Mäusen verwendet. Andere mAb produziert und gereinigt mit diesem Protokoll kann für Diedurchflusszytometrie verwendet werden (wenn konjugiert zu einem Fluorophor oder in Verbindung mit einem sekundären Ab), ELISA, oder Western Blotting.

References

  1. Lipman NS, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources. ILAR Journal, 46 (3), 258-268 (2005).
  2. Arora S, Ayyar BV, O'Kennedy R. Affinity chromatography for antibody purification Methods Mol Biol. 1129, 497-516 (2014).
  3. Henry BJ. On a new substance occurring in the urine of a patient with mollities ossium. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 138, 55-62 (1848).
  4. Köhler G and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature. 256, 495-497 (1975).

Hinweis: Die Sterile Zellkulturtechnik sollte beim sterilen Umgang mit den Hybridomzellen und den Medien (z. B. in einem Biosicherheitsschrank) bis zu den Antikörperreinigungsschritten aufrechterhalten werden.

1. Auftauen gefrorener Hybridomzellen

  1. Inkubieren Sie die Durchstechflasche mit den gefrorenen Hybridomzellen in einem 37°C Wasserbad, bis sie gerade aufgetaut ist (ca. 2 Minuten).
  2. Fügen Sie die aufgetauten Zellen zu einem 15 ml konischen Rohr hinzu, das 10 ml vollständiges RPMI enthält (RPMI ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 100 U/ml Penicillin, 100 g/mL Streptomycin, 1mM Natriumpyruvat, 1x nicht essentielle Säuren Aminosäuren, 50 m 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES).
  3. Zentrifuge für 5 min bei 1200 U/min, um alle kontaminierenden Gefriermedien auszuwaschen.
  4. Nach der Zentrifugation den flüssigen Überstand entsorgen und das Zellpellet in 5 ml frischem, vollständigem RPMI wieder aufhängen. Fügen Sie dann die Zellen zu einem T75-Gewebekulturkolben hinzu, der 15 ml vollständiges RPMI enthält (endletztes Volumen von RPMI beträgt 20 ml).
  5. Wachsen Sie die Zellen in einem Standard-Inkubator bei 37°C mit 5%CO2. Zellen sind in der Kultur nicht haftende.

2. Hybridom-Erweiterung

  1. Lassen Sie die Zellen für etwa 3 Tage zu erweitern, bis der Kolben ist 80% konfluent.
    Hinweis: Diese Zeit kann je nach Startzahl der Zellen sowie inhärenten Unterschieden in den Wachstumsraten verschiedener Zellen variieren. Es ist wichtig, dass sich die Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase befinden.
  2. Sobald der Anfangskolben die Koninfluenza von 80 % erreicht hat, entfernen Sie die Zellen aus diesem anfänglichen T75-Kolben, legen Sie sie in ein konisches Zentrifugenrohr und drehen Sie (1200 U/min für 5 min), um die Zellen zu pellet.
  3. Setzen Sie die Zellen in 6 ml vollständiger RPMI wieder auf, und verteilen Sie die Zellsuspension dann in drei neue T75-Kolben (2 ml/Kolben mit 18 ml RPMI). Inkubieren Sie diese drei T75-Kolben bei 37°C mit 5%CO2, bis sie zu 80% konfluent sind (Dies sollte ca. 3 Tage dauern).

3. Antikörperproduktion in serumfreiem Medium

Hinweis: An diesem Punkt sind die Zellen bereit, ihr Wachstum in einem serumfreien Medium fortzusetzen, das für das Wachstum von Hybridom-Zelllinien entwickelt wurde. In diesem Protokoll verwenden wir das gebrauchsfertige, handelsübliche HB Basal Liquid Medium, das das HB101 Supplement Produkt enthält.

  1. Die Zellen aus jedem der drei T75-Kolben (bei einer Konfluenz von 80 %) werden gesammelt und zentrifugiert (1200 U/min für 5 min).
  2. Das Zellpellet aus jedem T75-Kolben wird in 10 ml ergänztem HB101-Serummedium resuspendiert und dann zu zwei T225-Flaschen hinzugefügt, die HB101-Serum-freies Medium ergänzten (d. h. 5 ml Zellsuspension in jedem von 6 Kolben mit einem Inhalt von 220-240 ml HB101 in jedem Kolben).
  3. Die Zellen in T225-Flaschen und HB101-Medien bei 37 °C mit 5%CO2 für drei Wochen weiter anbauen, oder bis die Zellen zu sterben beginnen. Die Zellen produzieren mAb während dieser 3 Wochen und verschwiegen es in das Kulturmedium. Sobald die Zellen zu sterben beginnen, produzieren sie kein mAb mehr.

4. Antikörperreinigung - Tag 1

Hinweis: An dieser Stelle muss die Sterilität nicht aufrechterhalten werden, so dass ein steriler Umgang mit den Medien (z. B. in einem Biosicherheitsschrank) nicht erforderlich ist. Darüber hinaus werden Hybridome nicht als "BSL2-Level"-Agent betrachtet.

  1. Gießen Sie Medien aus den Kolben in Rohre für einen festen Winkelrotor. Drehen Sie die Rohre in einer Zentrifuge mit einem festen Winkelrotor bei 10.000 U/min für 8 Minuten. Dieser Schritt wurde entwickelt, um die zellulären Trümmer aus dem Kulturüberstand zu entfernen.
    Hinweis: Die Rohrgrößen können je nach verwendeter Rotor variieren. Wichtig ist, das gleiche Volumen in den Rohren zu haben, um sicherzustellen, dass der Rotor vor der Zentrifugation richtig ausbalanciert ist. Es ist wahrscheinlich, dass das gesamte Volumen der Medien nicht gleichzeitig in die Zentrifuge passt. Die restlichen Medien werden später (Schritt 4.5) mit den gleichen Rohren zentrifugiert.
  2. Bereiten Sie einen 2L Plastikbecher mit einer Rührstange in einem Eimer, der von Eis umgeben ist. Auf eine Rührplatte legen.
  3. Befestigen Sie eine 500 ml Filterplatte an einer 1L-Flasche. Befestigen Sie die Flaschen-Top-Filtereinheit, um Vakuum über geeignete Schläuche zu beherbergen.
  4. Gießen Sie den Überstand aus Schritt 4.1 (der noch das von den Hybridomzellen produzierte mAb enthält) in die Filteroberseite.
  5. Verwenden Sie weiterhin den gleichen Satz von Rohren, um Zellablagerungen aus den Medien zu pellet (das Pellet wird weiter zu bauen). Warten Sie, bis das Vakuum ausgeführt wird, bis die Filteroberseite voll ist und eine weitere Charge über den Überstand bereit ist, hineinzugießen. Lassen Sie den Filter nicht austrocknen oder die Filterung wird sehr langsam.
  6. Wenn die 1L-Flasche fast voll ist, entfernen Sie die Filterplatte und gießen Sie Überstand in 2L Becher in Schritt 4.2 vorbereitet. Schließen Sie das Filteroberteil wieder an. Verfolgen Sie die Lautstärke.
  7. Wiederholen Sie die Zentrifugations- und Filtrationsschritte, bis alle Medien verarbeitet sind.
  8. Messen Sie 295g Ammoniumsulfat pro 1L gefilterten Überstand gesammelt. Während des Rührens, langsam fügen Sie das Ammoniumsulfat dem Überstand in den nächsten paar Stunden (ca. 25 g alle 15 Minuten) langsam, um eine lokalisierte hohe Konzentration von Ammoniumsulfatsalz zu verhindern, die unerwünschte Proteine zum Niederschlag führen kann.
  9. Nachdem das gesamte Ammoniumsulfat zugegeben ist, den Becher mit Folie bedecken und mit der Rührplatte auf 4°C (z.B. begehbarer Kühlschrank oder Kühlraum) bewegen. Über Nacht umrühren. Um das Salz zu löslich zu machen, ist ein ständiges Rühren erforderlich, aber ein längeres Rühren kann zu einer Denaturierung der Proteine in der Lösung an der Oberflächen-/Luftschnittstelle führen.
  10. Waschen Sie die Rohre mit dem Festwinkelrotor.

5. Antikörperreinigung - Tag 2

  1. Gießen Sie das Ammoniumsulfat, das Überstand aus dem 2L-Becherglas enthält, in Rohre für einen festen Winkelrotor. Drehen Sie in Zentrifuge mit Festwinkelrotor bei 6500 U/min für 20 Minuten ohne Bremse.
  2. Vakuum aspirat den Überstand, achten Darauf, nicht das Pellet zu saugen, wie es weich sein wird. Verwenden Sie weiterhin den gleichen Satz von Rohren, um Pellet aus dem Ammoniumsulfat zu sammeln, das Überstand enthält.
  3. Nach der letzten Aspiration jedes Pellet (das Antikörper enthält) in 1 ml PBS wieder aussetzen.
  4. Entfernen Sie das Ammoniumsulfat aus der gefällten mAb-Lösung durch Dialyse gegen große Mengen pbS. Dazu zunächst ca. 1 Zoll Dialyseschlauch (z.B. Membra-Cel MD25-14 MWCO 12.000-14.000 Dalton Cut-off Cellulose Dialyseschläuche) für jeden ml mAb-Lösung schneiden. Befeuchten Sie den Schlauch mit dH2O. Binden Sie einen Knoten an einem Ende des Schlauches und füllen Sie ihn mit dH2O, um zu überprüfen, ob der Knoten nicht austritt. Leer dH2O aus dem Schlauch.
  5. Pipette PBS/Antikörperlösung in den Schlauch. Spülen Sie die Tuben mit einem zusätzlichen 0,25 ml PBS, und übertragen Sie auf die Schläuche.
  6. Sichern Sie die Oberseite des Schlauches so nah wie möglich an der Lösung mit einem orangefarbenen Dialyseclip.
  7. Kleben Sie die Oberseite des Schlauches an die Außenoberseite eines 4L Bechers. Lassen Sie den gefüllten Teil des Schlauches in den Becher hängen. Füllen Sie den Becher mit PBS und fügen Sie eine Rührstange hinzu.
  8. Über Nacht für 8 Stunden bei 4°C rühren.
  9. Ersetzen Sie die PBS im Becher durch frische PBS und rühren Sie für 8 Stunden zwei weitere Male.
  10. Den Antikörper aus dem Schlauch in 15- oder 50-ml-Konustuben übertragen. Zentrifuge für 5 Minuten bei 1200 U/min, um eventuelle Niederschlagserscheinungen zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand auf ein frisches Rohr.
  11. Verdünnen Sie ein Aliquot von Antikörper 1:20 mit PBS (5 l Antikörper + 95 l PBS). Quantitieren Sie die Antikörperkonzentration mit einem Spektralphotometer (leer mit PBS) bei 280 nm. Verwenden Sie einen Aussterbekoeffizienten () von 1,43. Die Konzentration wird als

  12. Aliquot den Antikörper in Schraubverschlussfläschchen und lagern bei -80°C.

Antikörper sind ein leistungsfähiges Werkzeug für Forschung und Diagnose, was bedeutet, dass es oft notwendig ist, sie in großen Mengen herzustellen.

Der erste Schritt zur Erzeugung von Antikörpern besteht darin, das Antigen von Interesse in ein Wirtstier zu injizieren. Das Antigen aktiviert die B-Zellen des Wirts, die dann Antikörper produzieren und freisetzen, die spezifisch für dieses Antigen sind. Anschließend wird das Antisera des Wirtstiers regelmäßig auf das Vorhandensein des Zielantikörpers unter Verwendung von ELISA oder einer anderen Detektionsmethode überprüft. Sobald es entdeckt wird, wird die Milz des Wirtstiers, die die B-Zellen enthält, entfernt. Wenn nun alle B-Zellen aus der Milz isoliert sind, sollte dies eine Population umfassen, die Antikörper gegen das Antigen von Interesse absondert. Wir bezeichnen diese Population als polyklonal, da jede Zelle wahrscheinlich an ein anderes Epitop des Antigens gebunden ist und daher ihren eigenen individuellen und einzigartigen Antikörper erzeugt hat.

Um monoklonale Antikörper zu erzeugen, müssen Antikörper, die angehoben werden, um ein bestimmtes Epitop zu erkennen, die einzelne B-Zelle, die den gewünschten Antikörper produziert, zunächst isoliert und kultiviert werden. Leider überleben B-Zellen in der Kultur nicht gut. Um diese Hürde zu überwinden, verschmelzen Wissenschaftler B-Zellen mit unsterbsamen Myelomzellen, was zu Hybridomen führt. Diese Zellen werden dann in einem selektiven Medium angebaut, das nur die Hybridome wachsen und Antikörper freisetzen lässt. Auch hier wird das Medium mit einer Methode wie ELISA für den gewünschten Antikörper gescreent. Sobald es entdeckt wird, werden die Hybridome über einen Prozess geklont, der als Limiting-Verdünnung bezeichnet wird, eine serielle Verdünnung der Übergeordnetenkultur, die dazu führen sollte, dass einzelne Zellen in die Brunnen einer Siebplatte gesät werden. Dies ermöglicht das Wachstum von Hybridomen aus einer einzigen übergeordneten Zelle, wodurch eine monoklonale Zelllinie entsagt wird, die nur den gewünschten Antikörper freisetzt. Diese monoklonalen Linien können in Gewebekulturkolben erweitert werden, um große Mengen monoklonaler Antikörper zu produzieren. Danach, wenn die Zellen absterben, können die Antikörper aus dem Medium mit Ammoniumsulfat ausgefällt werden. Normalerweise interagieren Antikörper in Lösung durch hydrophile Wechselwirkungen mit Wasser. Ammonium und Sulfat sind jedoch hochgeladene Ionen, die die Wassermoleküle von den Antikörpern trennen, wodurch die Löslichkeit der Antikörper verringert wird und sie ausfallen.

Überprüfen Sie zunächst die Materialliste, und bereiten Sie zunächst alle Medien, Verbrauchsmaterialien und Arbeitsflächen für das Protokoll vor.

Dann schalten Sie ein Wasserbad ein und stellen Sie es auf 37 Grad Celsius. Als nächstes fügen Sie 10 Milliliter komplettes RPMI zu einem 15-Milliliter konischen Rohr und 15 Milliliter vollständiger RPMI zu einem T75-Zellkulturkolben hinzu und legen sie beiseite. Entfernen Sie mit Vorsicht und dem Tragen der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung die gefrorene Durchstechflasche, die Hybridomzellen enthält, aus der Flüssigkeitsstickstofflagerung. Um den Druck in der Durchstechflasche loszulassen, lösen Sie die Kappe leicht. Jetzt bebrüten Sie sorgfältig die Durchstechflasche im Wasserbad, um sicherzustellen, dass die Kappe über der Wasseroberfläche bleibt, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination zu minimieren. Wenn die Zellen fast aufgetaut sind, was in der Regel etwa zwei Minuten dauert, bewegen Sie die Durchstechflasche zur Gewebekulturhaube.

Wischen Sie dann die Außenseite der Durchstechflasche mit 70% Ethanol ab, bevor Sie die Kappe entfernen. Übertragen Sie die Zellen mit einer sterilen Pipette in das konische Rohr, das 10 Milliliter komplettes RPMI-Medium enthält. Zentrifugieren Sie das Rohr dann für fünf Minuten bei 1200 U/min. Nach der Zentrifugation das Rohr zurück zur Gewebehaube bewegen und die Außenseite des Rohres mit Ethanol abwischen. Ohne das Pellet zu stören, entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie dann fünf Milliliter frisches komplettes RPMI-Medium und sanfte Pipette nach oben und unten hinzu, um sie wieder aufzuhängen. Als nächstes übertragen Sie die Zellen in den T75-Zellkulturkolben und legen Sie den Kolben in einen 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Lassen Sie die Zellen etwa 80% Konfluenz erreichen, was in der Regel etwa drei Tage dauert. Beachten Sie, dass Hybridomzellen nicht haftende sind und im Medium suspendiert wachsen. Die Zeit bis zur Erreichung einer ausreichenden Konfluenz kann je nach der Startzahl der lebenden Zellen und der Art der verwendeten Hybridomzelle variieren.

Sobald die Zellen ausreichend konfluent sind, verwenden Sie eine sterile 25-Milliliter-Pipette, um sie aus dem Kulturkolben in ein konisches Zentrifugenrohr zu übertragen. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 1200 U/min für fünf Minuten. Während sich die Zellen in der Zentrifuge befinden, fügen Sie 18 Milliliter vollständigen RPMI in jede der drei neuen T75-Zellkulturkolben ein und legen Sie diese beiseite. Nach der Zentrifugation den Überstand entfernen und das Zellpellet vorsichtig in sechs Millilitern kompletten RPMI wieder aufhängen. Fügen Sie als Nächstes zwei Milliliter der Zellsuspension in jeden der drei neuen Zellkulturkolben ein. Schließlich legen Sie die Kolben in einen Inkubator eingestellt 5% Kohlendioxid und 37 Grad Celsius und inkubieren, bis die Kolben sind etwa 80% konfluent, etwa drei Tage.

An dieser Stelle sind die Zellen bereit, ihr Wachstum in dem serumfreien Medium für Hybridom-Zelllinien fortzusetzen, wie z. B. kommerziell erhältliches HB Basal Liquid Medium, das die HB101-Ergänzung enthält. Übertragen Sie die Zellen aus jedem Zellkulturkolben in konische Zentrifugenröhren und pellet die Zellen dann fünf Minuten lang durch Zentrifugation bei 1200 U/min. Fügen Sie nun 230 Milliliter ergänztes HB101-Serum-freies Medium in jeweils sechs 225-Zentimeter-Quadrat-Zellkulturkolben ein und legen Sie sie beiseite. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie jedes Pellet in 10 Milliliter nupzierten HB101 Medium. Dann, in jedem Zellkulturkolben, fügen Sie fünf Milliliter der Zellsuspension hinzu. Legen Sie die Kolben in den 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius und weiter die Zellen für etwa drei Wochen wachsen. Während dieser Zeit produzieren und geben die Zellen den monoklonalen Antikörper von Interesse in das Kulturmedium frei und der Antikörper wird bereit für die Reinigung sein, wenn die Zellen zu sterben beginnen.

Um den zellulären Schmutz aus den antikörperhaltigen Kulturmedien zu entfernen, gießen Sie den Inhalt der Kulturkolben in Rohre für einen festen Winkelrotor. Legen Sie die Rohre in den Rotor und stellen Sie sicher, dass sie vor der Zentrifugation richtig ausbalanciert sind. Drehen Sie die Rohre bei 10.000 U/min für acht Minuten. Während die Proben zentrifugieren, legen Sie einen Zweiliter-Plastikbecher mit Rührstange in einen Eiskübel und legen Sie den Eiskübel dann auf eine Rührplatte.

Als nächstes befestigen Sie eine 500-Milliliter-Filterplatte an einer Ein-Liter-Flasche. Befestigen Sie diese Flaschen-Top-Filtereinheit mit den entsprechenden Schläuchen an einem Hausvakuum. Dann gießen Sie den Überstand, der den Antikörper enthält, in die Filteroberseite. Zentrifugieren Sie die verbleibenden Medien, um die Zellablagerungen vom antikörperhaltigen Überstand zu trennen. Wenn die Filterplatte voll von Überstand ist, starten Sie das Vakuum. Wenn die Ein-Liter-Sammelflasche dann fast voll ist, entfernen Sie die Filterplatte und gießen Sie den gefilterten Überstand in den Zweiliter-Becher auf Eis. Wiederholen Sie die Filtrationsschritte, bis der gesamte Überstand verarbeitet ist.

Wenn die gesamte Probe verarbeitet ist, wiegen Sie 295 Gramm Ammoniumsulfat pro Liter gefilterten Überstands. Beginnen Sie die Rührplatte und fügen Sie das Ammoniumsulfat in den nächsten Stunden langsam dem Überstand hinzu. Dies verhindert eine lokalisierte hohe Konzentration von Ammoniumsulfatsalz, die unerwünschte Proteine ausbrechen lassen kann. Nachdem das gesamte Ammoniumsulfat zugegeben ist, bedecken Sie den Becher mit Folie und bewegen Sie es zusammen mit der Rührplatte in einen Kühlraum bei vier Grad Celsius und stellen Sie ihn so ein, dass er die Antikörperlösung über Nacht rührt.

Am nächsten Morgen die Ammoniumsulfat-haltige Antikörperlösung aus dem Zweiliterbecher in saubere Rohre für den Festwinkelrotor gießen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 6500 U/min für 20 Minuten ohne Pause, um den Antikörper an der Unterseite der Rohre zu pellet. Als nächstes, Vakuum aspirat den Überstand, mit Vorsicht nicht das weiche Pellet zu saugen. Verwenden Sie weiterhin den gleichen Satz von Rohren, um den pelletierten Antikörper aus dem Rest des Ammoniumsulfat-haltigen Überstandes zu sammeln. Nach der letzten Aspiration jedes Antikörperpellet in etwa einem Milliliter PBS wieder aussetzen.

Um das Ammoniumsulfat aus der Antikörperlösung zu entfernen, schneiden Sie zunächst etwa einen Zoll Dialyseschlauch für jeden Milliliter Antikörperlösung. Als nächstes wischen Sie die Schläuche mit destilliertem Wasser ab und binden Sie einen Knoten an einem Ende des Schlauches. Füllen Sie die Schläuche mit destilliertem Wasser, um die Leckage aus dem Knoten zu überprüfen. Wenn es nach ein paar Minuten keine Leckage gibt, entleeren Sie das Wasser aus dem Schlauch.

Als nächstes pipette die Antikörperlösung in den Schlauch. Um so viel Antikörper wie möglich zurückzugewinnen, spülen Sie die Schläuche mit zusätzlichen 0,25 MilliliterPBS ab und übertragen Sie diese auch auf die Schläuche. Sichern Sie die Oberseite des Schlauches so nah wie möglich an der Lösung mit einem Dialyseclip. Dann kleben Sie die Oberseite des Schlauches an die Außenoberseite eines Vierliter-Bechers mit dem gefüllten Teil des Schlauches, der in den Becher hängt. Nun nehmen Sie das Becherglas in den vier Grad Celsius kalten Raum und legen Sie es auf eine Rührplatte. Füllen Sie den Becher oben mit PBS und fügen Sie eine Rührstange hinzu. Lassen Sie die Röhre und die Lösung über Nacht für etwa acht Stunden rühren. Am nächsten Morgen die PBS im Becher durch frische PBS ersetzen und dann den Becher für etwa acht Stunden wieder rühren lassen. Später am Abend wiederholen Sie den Vorgang ein letztes Mal. Am Morgen das Dialyserohr öffnen und dann die Antikörperlösung aus den Schläuchen in 15-Milliliter Konusröhren übertragen. Um alle Niederschlagsmittel zu entfernen, die sich während der Dialyse gebildet haben könnten, zentrieren Sie die Rohre für fünf Minuten bei 1200 U/min. Schließlich übertragen Sie den Überstand auf frische Schläuche.

Um die Antikörperkonzentration zu quantifizieren, machen Sie zunächst eine 20-fache Verdünnung, indem Sie fünf Mikroliter aus einem Antikörper, der aliquot zu 95 Mikroliter PBS hinzufügt, hinzufügen. Dann pipette den verdünnten Antikörper in eine Küvette und verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Konzentration bei 280 Nanometern aufzuzeichnen. Berechnen Sie als Nächstes die Antikörperkonzentration mit der gezeigten Formel. Schließlich beschriften Sie Schraubverschlussfläschchen mit dem Antikörpernamen, der Konzentration, dem Herstellungsdatum und gegebenenfalls der Chargennummer und dem Experimentiernamen, und aliquotieren Sie dann den Antikörper in die beschrifteten Schraubverschlussfläschchen. Diese können bis zum Bedarf bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.

Beispielerträge mit der 120G8 Anti-Maus-CD317 oder PDCA-1 Hybridom-Linie reichten zwischen 44 und 99,6 Milligramm, was in der Regel ergibt, im Durchschnitt 67,3 Milligramm Menge. Es ist wichtig zu beachten, dass jeder Produktionslauf mit der gleichen Hybridom-Zelllinie in der Menge an monoklonalen Antikörpern, die am Ende verfügbar sind, leicht unterschiedlich sein kann.

JoVE Science Education is free through June 15th 2020.

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