Immunfluoreszenzmikroskopie: Immunfluoreszenzfärbung paraffin-embedded Tissue Sections

Immunology

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Concepts

Quelle: Thomas Chaffee1, Thomas S. Griffith2,3,4, und Kathryn L. Schwertfeger1,3,4
1 Institut für Labormedizin und Pathologie, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
2 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
3 Freimaurerkrebszentrum, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
4 Zentrum für Immunologie, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Pathologische Analysen von Gewebeabschnitten können verwendet werden, um ein besseres Verständnis der normalen Gewebestruktur zu erhalten und zu unserem Verständnis von Krankheitsmechanismen beizutragen. Gewebebiopsien, entweder von Patienten oder aus experimentellen In-vivo-Modellen, werden oft durch Fixierung in Formalin oder Paraformaldehyd und Einbettung in Paraffinwachs konserviert. Dies ermöglicht eine langfristige Lagerung und die Verteilung des Gewebes. Gewebe werden mit einem Mikrotome in dünne Abschnitte (5 m) geschnitten und die Abschnitte auf Glasgletten verkleben. Die Gewebeabschnitte können mit Antikörpern gefärbt werden, die den Nachweis bestimmter Proteine innerhalb der Gewebeabschnitte ermöglichen. Färbung mit Antikörpern, die mit Fluorophoren konjugiert sind (auch als Fluorchrome bekannt) - Verbindungen, die Licht bei bestimmten Wellenlängen emittieren, wenn sie von einem Laser angeregt werden - wird als Immunfluoreszenz bezeichnet. Die Fähigkeit, Proteine innerhalb eines Abschnitts zu erkennen, kann Informationen wie Die heterogenität der Zelltypen im Gewebe, die Aktivierung bestimmter Signalwege und die Expression von Biomarkern liefern. Je nach verwendetem Fluorophor und Art des für die Analyse verfügbaren Mikroskops können mehrere Farben verwendet werden, was eine Multiplexanalyse von Zielen ermöglicht.

Das folgende Protokoll beschreibt die grundlegenden Schritte bei der Immunfluoreszenzfärbung von Paraffin-eingebetteten Gewebeabschnitten. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll keine Details über die Fixierung von Gewebe, den Prozess der Paraffineinbettung oder das Teilen des Gewebes enthalten wird. Nachdem Gewebe geschnitten und auf Glasrutschen platziert wurden, werden sie durch eine Reihe von abgestuften Ethanol -Inkubationen (EtOH) rehydriert. Die Abschnitte werden mit einem blockierenden Reagenz inkubiert, um die unspezifische Bindung von Antikörpern an den Gewebeabschnitt zu reduzieren. Die Abschnitte werden dann mit einem primären Antikörper inkubiert, der direkt mit einem Fluorophor beschriftet werden kann oder auch nicht. Wenn der primäre Antikörper nicht direkt beschriftet ist, werden die Abschnitte mit einem sekundären Antikörper beziffert, der mit einem Fluorophor gekennzeichnet ist. Verschiedene Antikörper können unterschiedliche Färbebedingungen erfordern, daher sind Vorschläge zur Optimierung von Antikörpern enthalten. Nach dem Waschen, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen, werden die Dias mit Medien montiert, die DAPI enthalten, um den Kern fluoreszierend zu kennzeichnen. Sobald das Montagemedium getrocknet ist, können die Dias mit einem Mikroskop mit Lasern abgebildet werden, die die verschiedenen Fluorophore erkennen können.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Immunologie. Immunfluoreszenzmikroskopie: Immunfluoreszenzfärbung paraffin-embedded Tissue Sections. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Procedure

1. Einrichtung

  1. Das typische Färbeprotokoll umfasst die folgenden Schritte:
    1. Rehydratisierung der Gewebeabschnitte auf den Dias mit einer Reihe von abgestuften Ethanolen.
    2. Inkubation der Gewebeabschnitte mit einem Sperrpuffer, der dazu beiträgt, die unspezifische Bindung von Antikörpern an das Gewebe zu blockieren und die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren.
    3. Entfernen des Sperrpuffers und Inkubation des Abschnitts im primären Antikörper, zu diesem Zeitpunkt bindet der Antikörper sein Peptidziel.
    4. Entfernen des primären Antikörpers und Waschen der Abschnitte ausgiebig im Waschpuffer.
    5. Inkubation der Abschnitte mit sekundärem Antikörper, um eine Bindung an primärer Antikörper zu ermöglichen, wenn der primäre Antikörper nicht direkt mit einem Fluorophor gekennzeichnet ist und ein sekundärer Antikörper erforderlich ist.
    6. Waschen des sekundären Antikörpers von den Dias.
    7. Montage der Dias in Montagemedien und Trocknen vor der Visualisierung auf einem Fluoreszenzmikroskop.
  2. Folgende Gegenstände werden benötigt: Gleithalter (Glas oder Kunststoff), Gläser, Pipetten, Pap-Stift, feuchte Kammer, Deckelscheine und Montagemedien mit DAPI.
  3. Xylol wird zur Rehydrierung von Dias verwendet. Xylol ist gefährlich und sollte in einer Dunstabzugshaube zusammen mit geeigneten PSA, einschließlich Handschuhen und einem Labormantel, verwendet werden.
  4. Rezepte für Puffer, Lösungen und Reagenzien
    1. Abgestufte Ethanole
      Ethanol - 160 ml 200 proof EtOH und 40mL ddH2O
      Ethanol - 140 ml 200 proof EtOH und 60mL ddH2O
    2. Antigen-Retrieval-Lösung
      10 mM Natriumcitrat, pH 6,0
    3. Blockierpuffer
      100 L Serum von Wirtstier, aus dem sekundärer Antikörper hergestellt wurde
      900 l 1X PBS
      Hinweis: Dies ist das Volumen für 10 Abschnitte; das Volumen je nach Bedarf für ca. 100 L Puffer pro Abschnitt anpassen.
    4. Waschpuffer (1X PBS)

2. Protokoll

  1. Rehydrierung mit Xylolen und Ethanolen
    1. Platzieren Sie Die Folien in einen Folienhalter, und tauchen Sie die Folien in die 100% Xylenisomere-Lösung ein, um sicherzustellen, dass die Folien vollständig mit Lösung abgedeckt sind.
    2. Inkubieren Sie Dias in den 100% Xylol-Isomere für 3 min. Wiederholen Sie zweimal für insgesamt 3 separate Inkubationen. Achten Sie darauf, das Schiebegeregal mit einem Papiertuch abzuwischen, bevor Sie auf eine neue Lösung übertragen werden, um Verunreinigungen zu minimieren.
      Hinweis: Es wird empfohlen, diese Inkubationen in drei separaten Behältern durchzuführen.
    3. Inkubieren Sie Dias in 100% EtOH für 2 min. Wiederholen Sie zweimal für insgesamt 3 separate Inkubationen.
      Hinweis: Es wird empfohlen, diese Inkubationen in drei separaten Behältern durchzuführen.
    4. Inkubieren Sie Dias in 95% EtOH für 2 min.
    5. Inkubieren Sie Dias in 80% EtOH für 2 min.
    6. Inkubieren Sie Dias in 70% EtOH für 2 min.
    7. Inkubieren Sie Dias in 1X PBS für 5 min.
  2. (Optional) Antigen-Retrieval zur Entlarvung von Epitopen, die vom primären Antikörper erkannt werden
    Anmerkung 1: Dieses Verfahren ist stark von dem verwendeten Antikörper abhängig, und es wird empfohlen, erste Optimierungsverfahren durchzuführen, um die Anforderung für den Antigenabruf zu bestimmen.
    Anmerkung 2: Dieses Verfahren wurde nicht mit der unten gezeigten F4/80-Färbung durchgeführt. Die Anforderung für den Antigenabruf sollte mit jedem neuen Antikörper optimiert werden.
    1. Legen Sie Dias in einen hitzebeständigen Kunststoff- oder Glasschieberhalter und stellen Sie sicher, dass das Rack mit Dias gefüllt ist, um eine gleichmäßige Wärmeverteilung zu gewährleisten. Leere Folien können verwendet werden, wenn sich weniger Samples als Steckplätze im Rack befinden.
    2. Rack in 1000 ml Antigen-Entlarvungslösung in 2L Becher - 10 ml Antigen-Entlarvung stämmenden Bestand auf 990 ml Wasser legen.
    3. Mikrowelle auf hoch für insgesamt 20 Minuten, stellen Sie sicher, dass Die Rutschen mit Wasser bedeckt bleiben.
    4. Kühle Rutschen für 20 Minuten im Becher.
    5. Gleitträger in Schiebehaltern mit ddH2O für jeweils 5 min waschen. Wiederholen Sie dies zweimal für insgesamt 3 separate Inkubationen mit frischem ddH2O jedes Mal. Die Dias können bei jeder Wäsche im selben Diahalter gewaschen werden.
    6. Inkubieren Sie Dias in 1X PBS für 5 min.
  3. Kreisabschnitte mit einem Pap-Stift. Dies ermöglicht die Verwendung eines minimalen Volumens von Puffern, die zur Abdeckung der Gewebeabschnitte benötigt werden. Lassen Sie die Gewebeabschnitte nicht austrocknen.
  4. Fügen Sie jedem Abschnitt einen Blockierungspuffer hinzu. Die Menge des Puffers, der für die Abdeckung des Abschnitts benötigt wird, variiert je nach Größe des Abschnitts, kann aber zwischen 25-500 l liegen. Es sollte genügend Puffer verwendet werden, um eine Perle zu bilden, die die gesamte Schnittfläche einschließlich der Kanten abdeckt.
    Hinweis: Die Auswahl des Blockierpuffers kann je nach verwendeter Antikörper variieren. Beispielsweise können 10 % Serum des Wirtstiers, in dem der sekundäre Antikörper aufgezogen wurde, verwendet werden, um die unspezifische Bindung des sekundären Antikörpers zu reduzieren (z. B. kann normales Ziegenserum verwendet werden, wenn der sekundäre Antikörper in Ziege aufgebracht wurde). Für jeden primären Antikörper sollte eine Optimierung des Blockierungspuffers durchgeführt werden. Um Brusttumorabschnitte mit F4/80 zu färben, wurde 0,1 ml von 10% normalem Ziegenserum in PBS verwendet.
  5. Inkubieren Sie die Abschnitte im Sperrpuffer in einer befeuchteten Kammer für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder 4°C bis zu 24 Stunden. Die befeuchtete Kammer sorgt dafür, dass die Abschnitte nicht austrocknen.
  6. Entfernen Sie den Sperrpuffer, indem Sie ihn von der Folie ablassen. Alternativ kann der Sperrpuffer mit einer Pipette entfernt werden, wobei darauf zu achten ist, den Abschnitt nicht mit der Pipettenspitze zu berühren.
  7. Verdünnen Sie den primären Antikörper im Blockierpuffer.
    Hinweis: Die richtige Verdünnung muss für jeden Antikörper- und Probentyp bestimmt werden. Die Optimierung würde die Durchführung einer Reihe von Verdünnungen umfassen, um eine optimale Färbung zu identifizieren. Um Brusttumorabschnitte mit F4/80 zu färben, wurden Gewebeabschnitte über Nacht bei 4°C in 0,1 ml Rattenanti-F4/80-Antikörper verdünnt 1:100 in 1% normalem Ziegenserum in PBS inkubiert.
  8. Fügen Sie den primären Antikörper zu jedem Abschnitt hinzu und inkubieren Sie in einer befeuchteten Kammer bis zu 16 Stunden (über Nacht) bei 4°C. Lassen Sie mindestens einen Abschnitt im Blockierpuffer ohne primären Antikörper als Kontrolle dienen, was dazu beiträgt, die unspezifische Bindung durch den sekundären Antikörper zu identifizieren.
  9. Entleeren Sie den primären Antikörper oder Sperrpuffer aus dem Abschnitt, und waschen Sie Abschnitte mit PBS, indem Sie Dias in das Schiebeträgerlegen und in einen Schiebehalter mit 1x PBS legen. Waschen Sie 3 mal für 10 min jedes Mal.
  10. Verdünnen Sie den sekundären Antikörper 1:200 im Blockierpuffer. Die Verdünnung kann je nach Sekundärantikörper optimiert werden.
  11. Fügen Sie den sekundären Antikörper zu allen Abschnitten hinzu, einschließlich der Steuerung, und brüten Sie 1 Stunde lang in einer befeuchteten Kammer, die vor Licht geschützt ist.
  12. Den sekundären Antikörper von den Abschnitten abtropfen lassen und jedes Mal 10 min in PBS waschen.
  13. Fügen Sie den Dias 2-3 Tropfen Montagemedien mit DAPI hinzu und legen Sie einen Deckzettel auf die Proben. Wenn es sich bei dem Montagemedium nicht um ein schnell trocknendes Medium handelt, kann es notwendig sein, die Ränder des Schlittens mit geschmolzenem Paraffinwachs oder Fingernagellack zu versiegeln, um Leckagen zu verhindern und die Proben langfristig zu halten.
  14. Lassen Sie die Dias über Nacht im Dunkeln trocknen und stellen Sie die Abschnitte mit einem Fluoreszenzmikroskop ab.

3. Datenanalyse und Ergebnisse

  1. Gefärbte Abschnitte werden mit einem Fluoreszenzmikroskop analysiert. Die spezifischen Details der Bildaufnahme und -analyse hängen von den Spezifikationen des Mikroskops und der Software ab, die für die Analyse verwendet wird. In der Regel können Bilder als einfarbige Bilder aufgenommen und überlappend gemacht werden, um mehrfarbige Bilder zu erzeugen. Prozentpositive Zellen können quantifiziert werden, indem die Anzahl der positiv gefärbten Zellen gezählt und durch die Gesamtzahl der DAPI-gefärbten Zellen innerhalb eines Abschnitts dividiert wird. Für F4/80-Färbung von Brusttumorabschnitten wurden mit der Software Leica Application Suite, Version 3.8, unter der Registerkarte Acquire und im Bild-Overlay-Erfassungsmodus DAPI und RFP aktiviert. Exposure, Gain und Gamma wurden angepasst (20,0 ms, 1,0x bzw. 1,53 für DAPI und 944,2 ms, 1,0x bzw. 1,08 für RFP), obwohl dies zwischen den Experimenten variiert. Die Schaltfläche Overlay erfassen wurde verwendet, um Overlay-Bilder der DAPI- und RFP-Belichtungen zu erstellen.
  2. Das Bild unten (Abbildung 1) zeigt ein Beispiel-Immunfluoreszenzbild eines mit F4/80 gebeizten Tumorabschnitts, der ein Antigen an Makrophagen und anderen myeloiden Zellen erkennt. Der Abschnitt wurde mit DAPI-haltigen Montagemedien montiert und die Kerne sind blau dargestellt.

Die Funktion eines Proteins in einer Zelle hängt weitgehend von seiner richtigen Lokalisierung innerhalb der Zelle ab. Die Immunfluoreszenzmikroskopie ist eine Methode, mit der ein Protein in Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen visualisiert werden kann. Ein Fluoreszenzfarbstoff ist ein Fluorophor, d. h. ein Molekül, das Lichtenergie bei einer bestimmten Wellenlänge durch einen Prozess namens Anregung absorbiert und dann sofort die Energie bei einer anderen Wellenlänge, der sogenannten Emission, abgibt.

Fluoreszierende Farbstoffe werden zu einem zielspezifischen Antikörper konjugiert und durch Immunfärbung in kultivierte Zellen oder Gewebe eingeführt. Wenn dieser primäre Antikörper an das Protein von Interesse bindet, wird das Protein mit dem Fluoreszenzfarbstoff gekennzeichnet. Alternativ kann der Fluoreszenzfarbstoff anstelle des primären Antikörpers zu einem sekundären Antikörper konjugiert werden, und der sekundäre Antikörper bindet an den Protein-Primärantikörperkomplex, um das Ziel zu kennzeichnen. Danach wird die Probe in einem Antifade-Montagemedium versiegelt, um die Fluoreszenz-Etikettierung zu erhalten, und ist dann bereit für die Bildgebung auf einem Fluoreszenzmikroskop.

Ein Fluoreszenzmikroskop ist mit einer leistungsstarken Lichtquelle ausgestattet. Der Lichtstrahl durchläuft zunächst einen Anregungsfilter, der nur das Licht an der Anregungswellenlänge passieren lässt. Das Anregungslicht erreicht dann einen speziellen Spiegel, einen sogenannten dichroitischen Spiegel oder einen Strahlsplitter, der die Anregungswellenlänge selektiv in Richtung einer Objektivlinse reflektiert. Die Linse fokussiert das Licht dann auf einen kleinen Bereich in der Probe. Beim Erreichen der Probe erregt das Licht die Fluorophore, die dann die Lichtenergie bei einer anderen Wellenlänge abgeben. Dieses Licht wird durch die Objektivlinse zurück zum dichroitischen Spiegel übertragen. Da sich die Emissionswellenlänge von der Anregungswellenlänge unterscheidet, lässt der dichroitische Spiegel das Emissionslicht passieren. Dann geht es durch einen zweiten Filter, den sogenannten Emissionsfilter, der Licht von allen anderen Wellenlängen eliminiert, die vorhanden sein können. Danach erreichen die Lichtstrahlen nun das Okular oder die Kamera, wo sie ein vergrößertes Bild präsentieren, das aus dem emittierten Licht aus den spezifischen Fluorophoren erzeugt wird. Dieses Bild stellt die Position des Proteins dar, das in der Zelle von Interesse ist.

DNA-bindende Fluoreszenzfarbstoffe werden häufig zusammen mit Immunostainierung verwendet, um Kerne als Bezugspunkt innerhalb der Zellen zu kennzeichnen. Mehrere verschiedene Fluorophore mit unterschiedlichen Anregungsemissionswellenlängen können für verschiedene Proteine innerhalb derselben Probe verwendet werden, um die Lokalisation der Proteine zu vergleichen.

Dieses Video zeigt das Verfahren zur immunfluoreszenten Färbung eines Proteins von Interesse in einer Gewebeprobe, gefolgt von der Abbildung der Probe auf einem Fluoreszenzmikroskop.

Bevor der Färbevorgang begonnen wird, müssen die Abschnitte, die während des Einbettungsprozesses dehydriert wurden, rehydriert werden. Um dies zu tun, legen Sie zuerst die Dias in einen Diahalter und tauchen Sie dann die Dias vollständig in 100% Xlene-Isomer ein. Lassen Sie die Folien drei Minuten lang inkubieren. Dann entfernen Sie die Rutschen aus dem Behälter, wischen Sie überschüssiges Xylol mit einem Papiertuch ab und legen Sie sie in ein neues Xylolbad in einen frischen Behälter, für weitere drei Minuten. Wiederholen Sie diese Inkubation jedes Mal in einem neuen Behälter mit frischem Xylol und wischen Sie die Dias mit Papiertüchern ab, bevor Sie in den neuen Behälter überführen, für insgesamt drei Inkubationen. Als nächstes inkubieren Sie die Abschnitte in einer Reihe von abgestuften Ethanol-Lösungen, beginnend mit 100% Ethanol für zwei Minuten. Wischen Sie das Schiebegestell mit einem Papiertuch ab und übertragen Sie die Dias für weitere zwei Minuten in einen neuen Behälter mit 100 % Ethanol. Setzen Sie den Zyklus des Waschens, Wischen überschüssiges Ethanol mit einem Papiertuch, und die Übertragung der Rutschen in ein neues Bad, nach den angegebenen Konzentrationen von Ethanol für die angegebene Zeit. Nach dem letzten Ethanolwaschen die überschüssige Lösung abschütteln und die Dias in 1X PBS für fünf Minuten inkubieren.

Um den Färbungsprozess zu beginnen, kreisen Sie zunächst die Abschnitte mit einem PAP-Stift, um den minimalen Bereich zu identifizieren, den die Puffer abdecken müssen. Sobald die Abschnitte auf der Folie deutlich markiert sind, fügen Sie jedem Dia 100 Mikroliter Blockierpuffer hinzu, um sicherzustellen, dass die gesamte Abschnittsoberfläche abgedeckt ist. Nachdem die Gewebe mit einem Sperrpuffer bedeckt sind, legen Sie die Dias in eine befeuchtete Kammer. Lassen Sie die Dias für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.

Entfernen Sie den Sperrpuffer nach der gewünschten Inkubationszeit, indem Sie ihn von der Folie ablassen. Verdünnen Sie als Nächstes den primären Antikörper im Blockierpuffer. Für eine Verdünnung von 1:100 990 Mikroliter Blockierpuffer zu einem 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr hinzufügen, gefolgt von 10 Mikrolitern des primären Antikörpers an ein und demselben Rohr. Beschriften Sie eine Folie als Steuerelement, und fügen Sie dann 100 Mikroliter Blockierpuffer hinzu. Diese Kontrolle wird dazu beitragen, eine nicht spezifische Bindung des sekundären Antikörpers zu identifizieren. Fügen Sie nun 100 Mikroliter primärer Antikörperpuffer zu den verbleibenden Folien hinzu. Inkubieren Sie die Abschnitte über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei vier Grad Celsius, im Dunkeln.

Entfernen Sie nach der nächtlichen Inkubation die Abschnitte aus der Kammer und entleeren Sie den primären Antikörper von jedem Schlitten und den Blockierpuffer von der Steuerung. Legen Sie die Dias in ein Schieberegal und waschen Sie sie dann dreimal in 1X PBS für jeweils zehn Minuten. Während die Dias in 1X PBS waschen, verdünnen Sie den sekundären Antikörper im Sperrpuffer. Für eine Verdünnung von 1:200 995 Mikroliter Sperrpuffer zu einem 1,5 Milliliter-Rohr hinzufügen, gefolgt von fünf Mikrolitern des sekundären Antikörpers an ein und demselben Rohr. Fügen Sie den sekundären Antikörper zu allen Abschnitten, einschließlich der Steuerung, hinzu und inkubieren Sie sie für eine Stunde in einer befeuchteten Kammer, die vor Licht geschützt ist. Wenn der Timer ertönt, entfernen Sie die Folien aus dem Inkubator. Entleeren Sie den sekundären Antikörper von den Abschnitten. Sobald der sekundäre Antikörper entfernt wurde, legen Sie die Dias in ein Dia-Rack und tauchen Sie die Dias dann für 10 Minuten vollständig in 1X PBS ein, geschützt vor Licht. Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal, mit frischen 1X PBS für jede Wäsche. Fügen Sie nach dem Einwaschzwei bis drei Tropfen Montagemedien, die DAPI enthalten, zu jedem Dia hinzu und legen Sie einen Glasdeckel auf die Proben. Lassen Sie die Dias über Nacht an einem dunklen Ort trocknen, bevor Sie die Abschnitte mit einem fluoreszierenden Bereich bebildern.

Während der Bildgebung hängen die Details der Bildaufnahme vom jeweiligen Mikroskop und der verfügbaren Software ab. In diesem speziellen Beispiel jedoch die Software Leica Application Suite, Version 3. 8, wird verwendet, um die Analyse durchzuführen. Klicken Sie mit diesem Programm auf die Registerkarte "Erwerben" und aktivieren Sie im Modus Bild-Overlay-Erfassung sowohl DAPI als auch RFP. Passen Sie als Nächstes belichtung, Gain und Gamma für DAPI und RFP an, indem Sie eine Initiale mit den von der Software definierten Standardeinstellungen vornehmen und dann die Helligkeit optimieren, indem Sie die Belichtungszeit und die Verstärkung ändern, wobei zu berücksichtigen ist, dass minimale optimale Einstellungen bildsättigung und Photobleichung der Proben zu vermeiden. Gamma kann geändert werden, um dunklere Bereiche eines Bildes zu optimieren.

Sobald die Einstellungen angepasst wurden, drücken Sie die Schaltfläche Overlay erfassen, um Overlay-Bilder der DAPI- und RFP-Belichtungen zu erstellen. Dieses Mit der demonstrierten Technik aufgenommene Beispielbild zeigt einen Maus-Brusttumorabschnitt, der mit dem Antikörper F4/80 befleckt ist und ein rot dargestelltes Antigen auf Makrophagen und anderen myeloischen Zellen erkennt. Da DAPI-haltige Montagemedien verwendet wurden, werden Kerne blau dargestellt. Die Daten aus der Bildgebung liefern Informationen über die Intensität und Lokalisierung des Proteins innerhalb des Gewebeabschnitts.

Im Bild des mit F4/80 gebeizten Tumors wird beispielsweise die Zelloberflächenfärbung dieses Antigens beobachtet. Diese Daten können auch Informationen über die Häufigkeit bestimmter Zellpopulationen innerhalb des Gewebeabschnitts liefern. Dies kann quantifiziert werden, indem die Anzahl der positiv gefärbten Zellen, hier rot dargestellt, gezählt und mit der gesamten Zellpopulation verglichen wird, die blau dargestellt ist, und die Häufigkeit mit der folgenden Gleichung berechnet.

Results

Figure 1
Abbildung 1:F4/80 Färbung eines Brusttumorabschnitts. Nach der Fixierung wurde ein Maus-Mammary-Tumor mit Anti-F4/80 geschnitten und gebeizt und mit einem DAPI-haltigen Montagemedium montiert. Die Färbung wird durch die Zelloberfläche F4/80 Färbung in Rot gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die aus der Bildgebung gewonnenen Daten werden Informationen über die Intensität und Lokalisierung der Expression des Proteins von Interesse innerhalb des Gewebeabschnitts liefern. Je nach untersuchtem Protein könnten diese Daten auch Informationen über die Häufigkeit bestimmter Zellpopulationen innerhalb des Gewebeabschnitts liefern. Dies kann quantifiziert werden, indem die Anzahl der positiv gefärbten Zellen gezählt und mit der Gesamtzellpopulation verglichen wird.

Applications and Summary

Die Immunfluoreszenz ermöglicht die Untersuchung der Proteinexpression und -lokalisation im Rahmen eines Gewebeabschnitts. Diese Technik kann verwendet werden, um zu verstehen, wie sich Gewebe im Kontext von Krankheiten verändern, indem die Proteinlokalisierung oder die Zellzahl in normalen und kranken Geweben untersucht wird. Änderungen in der Lokalisierung oder in Ausdrucksmustern können bestimmt und mit bestimmten Attributen der Stichproben verknüpft werden.

References

  1. Im K, Mareninov S., Diaz MFP, Yong WH. An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Yong W. (eds) Biobanking. Methods in Molecular Biology. 1897, Humana Press, New York, NY (2019)
  2. Ramos-Vara JA. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Gautier JC. (eds) Drug Safety Evaluation. Methods in Molecular Biology. 1641, Humana Press, New York, NY (2017)
  3. Donaldson JG. Immunofluorescence Staining. Current protocols in Cell Biology. 69 (1):1 4.3.1-4.3.7. (2015)

1. Einrichtung

  1. Das typische Färbeprotokoll umfasst die folgenden Schritte:
    1. Rehydratisierung der Gewebeabschnitte auf den Dias mit einer Reihe von abgestuften Ethanolen.
    2. Inkubation der Gewebeabschnitte mit einem Sperrpuffer, der dazu beiträgt, die unspezifische Bindung von Antikörpern an das Gewebe zu blockieren und die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren.
    3. Entfernen des Sperrpuffers und Inkubation des Abschnitts im primären Antikörper, zu diesem Zeitpunkt bindet der Antikörper sein Peptidziel.
    4. Entfernen des primären Antikörpers und Waschen der Abschnitte ausgiebig im Waschpuffer.
    5. Inkubation der Abschnitte mit sekundärem Antikörper, um eine Bindung an primärer Antikörper zu ermöglichen, wenn der primäre Antikörper nicht direkt mit einem Fluorophor gekennzeichnet ist und ein sekundärer Antikörper erforderlich ist.
    6. Waschen des sekundären Antikörpers von den Dias.
    7. Montage der Dias in Montagemedien und Trocknen vor der Visualisierung auf einem Fluoreszenzmikroskop.
  2. Folgende Gegenstände werden benötigt: Gleithalter (Glas oder Kunststoff), Gläser, Pipetten, Pap-Stift, feuchte Kammer, Deckelscheine und Montagemedien mit DAPI.
  3. Xylol wird zur Rehydrierung von Dias verwendet. Xylol ist gefährlich und sollte in einer Dunstabzugshaube zusammen mit geeigneten PSA, einschließlich Handschuhen und einem Labormantel, verwendet werden.
  4. Rezepte für Puffer, Lösungen und Reagenzien
    1. Abgestufte Ethanole
      Ethanol - 160 ml 200 proof EtOH und 40mL ddH2O
      Ethanol - 140 ml 200 proof EtOH und 60mL ddH2O
    2. Antigen-Retrieval-Lösung
      10 mM Natriumcitrat, pH 6,0
    3. Blockierpuffer
      100 L Serum von Wirtstier, aus dem sekundärer Antikörper hergestellt wurde
      900 l 1X PBS
      Hinweis: Dies ist das Volumen für 10 Abschnitte; das Volumen je nach Bedarf für ca. 100 L Puffer pro Abschnitt anpassen.
    4. Waschpuffer (1X PBS)

2. Protokoll

  1. Rehydrierung mit Xylolen und Ethanolen
    1. Platzieren Sie Die Folien in einen Folienhalter, und tauchen Sie die Folien in die 100% Xylenisomere-Lösung ein, um sicherzustellen, dass die Folien vollständig mit Lösung abgedeckt sind.
    2. Inkubieren Sie Dias in den 100% Xylol-Isomere für 3 min. Wiederholen Sie zweimal für insgesamt 3 separate Inkubationen. Achten Sie darauf, das Schiebegeregal mit einem Papiertuch abzuwischen, bevor Sie auf eine neue Lösung übertragen werden, um Verunreinigungen zu minimieren.
      Hinweis: Es wird empfohlen, diese Inkubationen in drei separaten Behältern durchzuführen.
    3. Inkubieren Sie Dias in 100% EtOH für 2 min. Wiederholen Sie zweimal für insgesamt 3 separate Inkubationen.
      Hinweis: Es wird empfohlen, diese Inkubationen in drei separaten Behältern durchzuführen.
    4. Inkubieren Sie Dias in 95% EtOH für 2 min.
    5. Inkubieren Sie Dias in 80% EtOH für 2 min.
    6. Inkubieren Sie Dias in 70% EtOH für 2 min.
    7. Inkubieren Sie Dias in 1X PBS für 5 min.
  2. (Optional) Antigen-Retrieval zur Entlarvung von Epitopen, die vom primären Antikörper erkannt werden
    Anmerkung 1: Dieses Verfahren ist stark von dem verwendeten Antikörper abhängig, und es wird empfohlen, erste Optimierungsverfahren durchzuführen, um die Anforderung für den Antigenabruf zu bestimmen.
    Anmerkung 2: Dieses Verfahren wurde nicht mit der unten gezeigten F4/80-Färbung durchgeführt. Die Anforderung für den Antigenabruf sollte mit jedem neuen Antikörper optimiert werden.
    1. Legen Sie Dias in einen hitzebeständigen Kunststoff- oder Glasschieberhalter und stellen Sie sicher, dass das Rack mit Dias gefüllt ist, um eine gleichmäßige Wärmeverteilung zu gewährleisten. Leere Folien können verwendet werden, wenn sich weniger Samples als Steckplätze im Rack befinden.
    2. Rack in 1000 ml Antigen-Entlarvungslösung in 2L Becher - 10 ml Antigen-Entlarvung stämmenden Bestand auf 990 ml Wasser legen.
    3. Mikrowelle auf hoch für insgesamt 20 Minuten, stellen Sie sicher, dass Die Rutschen mit Wasser bedeckt bleiben.
    4. Kühle Rutschen für 20 Minuten im Becher.
    5. Gleitträger in Schiebehaltern mit ddH2O für jeweils 5 min waschen. Wiederholen Sie dies zweimal für insgesamt 3 separate Inkubationen mit frischem ddH2O jedes Mal. Die Dias können bei jeder Wäsche im selben Diahalter gewaschen werden.
    6. Inkubieren Sie Dias in 1X PBS für 5 min.
  3. Kreisabschnitte mit einem Pap-Stift. Dies ermöglicht die Verwendung eines minimalen Volumens von Puffern, die zur Abdeckung der Gewebeabschnitte benötigt werden. Lassen Sie die Gewebeabschnitte nicht austrocknen.
  4. Fügen Sie jedem Abschnitt einen Blockierungspuffer hinzu. Die Menge des Puffers, der für die Abdeckung des Abschnitts benötigt wird, variiert je nach Größe des Abschnitts, kann aber zwischen 25-500 l liegen. Es sollte genügend Puffer verwendet werden, um eine Perle zu bilden, die die gesamte Schnittfläche einschließlich der Kanten abdeckt.
    Hinweis: Die Auswahl des Blockierpuffers kann je nach verwendeter Antikörper variieren. Beispielsweise können 10 % Serum des Wirtstiers, in dem der sekundäre Antikörper aufgezogen wurde, verwendet werden, um die unspezifische Bindung des sekundären Antikörpers zu reduzieren (z. B. kann normales Ziegenserum verwendet werden, wenn der sekundäre Antikörper in Ziege aufgebracht wurde). Für jeden primären Antikörper sollte eine Optimierung des Blockierungspuffers durchgeführt werden. Um Brusttumorabschnitte mit F4/80 zu färben, wurde 0,1 ml von 10% normalem Ziegenserum in PBS verwendet.
  5. Inkubieren Sie die Abschnitte im Sperrpuffer in einer befeuchteten Kammer für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder 4°C bis zu 24 Stunden. Die befeuchtete Kammer sorgt dafür, dass die Abschnitte nicht austrocknen.
  6. Entfernen Sie den Sperrpuffer, indem Sie ihn von der Folie ablassen. Alternativ kann der Sperrpuffer mit einer Pipette entfernt werden, wobei darauf zu achten ist, den Abschnitt nicht mit der Pipettenspitze zu berühren.
  7. Verdünnen Sie den primären Antikörper im Blockierpuffer.
    Hinweis: Die richtige Verdünnung muss für jeden Antikörper- und Probentyp bestimmt werden. Die Optimierung würde die Durchführung einer Reihe von Verdünnungen umfassen, um eine optimale Färbung zu identifizieren. Um Brusttumorabschnitte mit F4/80 zu färben, wurden Gewebeabschnitte über Nacht bei 4°C in 0,1 ml Rattenanti-F4/80-Antikörper verdünnt 1:100 in 1% normalem Ziegenserum in PBS inkubiert.
  8. Fügen Sie den primären Antikörper zu jedem Abschnitt hinzu und inkubieren Sie in einer befeuchteten Kammer bis zu 16 Stunden (über Nacht) bei 4°C. Lassen Sie mindestens einen Abschnitt im Blockierpuffer ohne primären Antikörper als Kontrolle dienen, was dazu beiträgt, die unspezifische Bindung durch den sekundären Antikörper zu identifizieren.
  9. Entleeren Sie den primären Antikörper oder Sperrpuffer aus dem Abschnitt, und waschen Sie Abschnitte mit PBS, indem Sie Dias in das Schiebeträgerlegen und in einen Schiebehalter mit 1x PBS legen. Waschen Sie 3 mal für 10 min jedes Mal.
  10. Verdünnen Sie den sekundären Antikörper 1:200 im Blockierpuffer. Die Verdünnung kann je nach Sekundärantikörper optimiert werden.
  11. Fügen Sie den sekundären Antikörper zu allen Abschnitten hinzu, einschließlich der Steuerung, und brüten Sie 1 Stunde lang in einer befeuchteten Kammer, die vor Licht geschützt ist.
  12. Den sekundären Antikörper von den Abschnitten abtropfen lassen und jedes Mal 10 min in PBS waschen.
  13. Fügen Sie den Dias 2-3 Tropfen Montagemedien mit DAPI hinzu und legen Sie einen Deckzettel auf die Proben. Wenn es sich bei dem Montagemedium nicht um ein schnell trocknendes Medium handelt, kann es notwendig sein, die Ränder des Schlittens mit geschmolzenem Paraffinwachs oder Fingernagellack zu versiegeln, um Leckagen zu verhindern und die Proben langfristig zu halten.
  14. Lassen Sie die Dias über Nacht im Dunkeln trocknen und stellen Sie die Abschnitte mit einem Fluoreszenzmikroskop ab.

3. Datenanalyse und Ergebnisse

  1. Gefärbte Abschnitte werden mit einem Fluoreszenzmikroskop analysiert. Die spezifischen Details der Bildaufnahme und -analyse hängen von den Spezifikationen des Mikroskops und der Software ab, die für die Analyse verwendet wird. In der Regel können Bilder als einfarbige Bilder aufgenommen und überlappend gemacht werden, um mehrfarbige Bilder zu erzeugen. Prozentpositive Zellen können quantifiziert werden, indem die Anzahl der positiv gefärbten Zellen gezählt und durch die Gesamtzahl der DAPI-gefärbten Zellen innerhalb eines Abschnitts dividiert wird. Für F4/80-Färbung von Brusttumorabschnitten wurden mit der Software Leica Application Suite, Version 3.8, unter der Registerkarte Acquire und im Bild-Overlay-Erfassungsmodus DAPI und RFP aktiviert. Exposure, Gain und Gamma wurden angepasst (20,0 ms, 1,0x bzw. 1,53 für DAPI und 944,2 ms, 1,0x bzw. 1,08 für RFP), obwohl dies zwischen den Experimenten variiert. Die Schaltfläche Overlay erfassen wurde verwendet, um Overlay-Bilder der DAPI- und RFP-Belichtungen zu erstellen.
  2. Das Bild unten (Abbildung 1) zeigt ein Beispiel-Immunfluoreszenzbild eines mit F4/80 gebeizten Tumorabschnitts, der ein Antigen an Makrophagen und anderen myeloiden Zellen erkennt. Der Abschnitt wurde mit DAPI-haltigen Montagemedien montiert und die Kerne sind blau dargestellt.

Die Funktion eines Proteins in einer Zelle hängt weitgehend von seiner richtigen Lokalisierung innerhalb der Zelle ab. Die Immunfluoreszenzmikroskopie ist eine Methode, mit der ein Protein in Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen visualisiert werden kann. Ein Fluoreszenzfarbstoff ist ein Fluorophor, d. h. ein Molekül, das Lichtenergie bei einer bestimmten Wellenlänge durch einen Prozess namens Anregung absorbiert und dann sofort die Energie bei einer anderen Wellenlänge, der sogenannten Emission, abgibt.

Fluoreszierende Farbstoffe werden zu einem zielspezifischen Antikörper konjugiert und durch Immunfärbung in kultivierte Zellen oder Gewebe eingeführt. Wenn dieser primäre Antikörper an das Protein von Interesse bindet, wird das Protein mit dem Fluoreszenzfarbstoff gekennzeichnet. Alternativ kann der Fluoreszenzfarbstoff anstelle des primären Antikörpers zu einem sekundären Antikörper konjugiert werden, und der sekundäre Antikörper bindet an den Protein-Primärantikörperkomplex, um das Ziel zu kennzeichnen. Danach wird die Probe in einem Antifade-Montagemedium versiegelt, um die Fluoreszenz-Etikettierung zu erhalten, und ist dann bereit für die Bildgebung auf einem Fluoreszenzmikroskop.

Ein Fluoreszenzmikroskop ist mit einer leistungsstarken Lichtquelle ausgestattet. Der Lichtstrahl durchläuft zunächst einen Anregungsfilter, der nur das Licht an der Anregungswellenlänge passieren lässt. Das Anregungslicht erreicht dann einen speziellen Spiegel, einen sogenannten dichroitischen Spiegel oder einen Strahlsplitter, der die Anregungswellenlänge selektiv in Richtung einer Objektivlinse reflektiert. Die Linse fokussiert das Licht dann auf einen kleinen Bereich in der Probe. Beim Erreichen der Probe erregt das Licht die Fluorophore, die dann die Lichtenergie bei einer anderen Wellenlänge abgeben. Dieses Licht wird durch die Objektivlinse zurück zum dichroitischen Spiegel übertragen. Da sich die Emissionswellenlänge von der Anregungswellenlänge unterscheidet, lässt der dichroitische Spiegel das Emissionslicht passieren. Dann geht es durch einen zweiten Filter, den sogenannten Emissionsfilter, der Licht von allen anderen Wellenlängen eliminiert, die vorhanden sein können. Danach erreichen die Lichtstrahlen nun das Okular oder die Kamera, wo sie ein vergrößertes Bild präsentieren, das aus dem emittierten Licht aus den spezifischen Fluorophoren erzeugt wird. Dieses Bild stellt die Position des Proteins dar, das in der Zelle von Interesse ist.

DNA-bindende Fluoreszenzfarbstoffe werden häufig zusammen mit Immunostainierung verwendet, um Kerne als Bezugspunkt innerhalb der Zellen zu kennzeichnen. Mehrere verschiedene Fluorophore mit unterschiedlichen Anregungsemissionswellenlängen können für verschiedene Proteine innerhalb derselben Probe verwendet werden, um die Lokalisation der Proteine zu vergleichen.

Dieses Video zeigt das Verfahren zur immunfluoreszenten Färbung eines Proteins von Interesse in einer Gewebeprobe, gefolgt von der Abbildung der Probe auf einem Fluoreszenzmikroskop.

Bevor der Färbevorgang begonnen wird, müssen die Abschnitte, die während des Einbettungsprozesses dehydriert wurden, rehydriert werden. Um dies zu tun, legen Sie zuerst die Dias in einen Diahalter und tauchen Sie dann die Dias vollständig in 100% Xlene-Isomer ein. Lassen Sie die Folien drei Minuten lang inkubieren. Dann entfernen Sie die Rutschen aus dem Behälter, wischen Sie überschüssiges Xylol mit einem Papiertuch ab und legen Sie sie in ein neues Xylolbad in einen frischen Behälter, für weitere drei Minuten. Wiederholen Sie diese Inkubation jedes Mal in einem neuen Behälter mit frischem Xylol und wischen Sie die Dias mit Papiertüchern ab, bevor Sie in den neuen Behälter überführen, für insgesamt drei Inkubationen. Als nächstes inkubieren Sie die Abschnitte in einer Reihe von abgestuften Ethanol-Lösungen, beginnend mit 100% Ethanol für zwei Minuten. Wischen Sie das Schiebegestell mit einem Papiertuch ab und übertragen Sie die Dias für weitere zwei Minuten in einen neuen Behälter mit 100 % Ethanol. Setzen Sie den Zyklus des Waschens, Wischen überschüssiges Ethanol mit einem Papiertuch, und die Übertragung der Rutschen in ein neues Bad, nach den angegebenen Konzentrationen von Ethanol für die angegebene Zeit. Nach dem letzten Ethanolwaschen die überschüssige Lösung abschütteln und die Dias in 1X PBS für fünf Minuten inkubieren.

Um den Färbungsprozess zu beginnen, kreisen Sie zunächst die Abschnitte mit einem PAP-Stift, um den minimalen Bereich zu identifizieren, den die Puffer abdecken müssen. Sobald die Abschnitte auf der Folie deutlich markiert sind, fügen Sie jedem Dia 100 Mikroliter Blockierpuffer hinzu, um sicherzustellen, dass die gesamte Abschnittsoberfläche abgedeckt ist. Nachdem die Gewebe mit einem Sperrpuffer bedeckt sind, legen Sie die Dias in eine befeuchtete Kammer. Lassen Sie die Dias für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.

Entfernen Sie den Sperrpuffer nach der gewünschten Inkubationszeit, indem Sie ihn von der Folie ablassen. Verdünnen Sie als Nächstes den primären Antikörper im Blockierpuffer. Für eine Verdünnung von 1:100 990 Mikroliter Blockierpuffer zu einem 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr hinzufügen, gefolgt von 10 Mikrolitern des primären Antikörpers an ein und demselben Rohr. Beschriften Sie eine Folie als Steuerelement, und fügen Sie dann 100 Mikroliter Blockierpuffer hinzu. Diese Kontrolle wird dazu beitragen, eine nicht spezifische Bindung des sekundären Antikörpers zu identifizieren. Fügen Sie nun 100 Mikroliter primärer Antikörperpuffer zu den verbleibenden Folien hinzu. Inkubieren Sie die Abschnitte über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei vier Grad Celsius, im Dunkeln.

Entfernen Sie nach der nächtlichen Inkubation die Abschnitte aus der Kammer und entleeren Sie den primären Antikörper von jedem Schlitten und den Blockierpuffer von der Steuerung. Legen Sie die Dias in ein Schieberegal und waschen Sie sie dann dreimal in 1X PBS für jeweils zehn Minuten. Während die Dias in 1X PBS waschen, verdünnen Sie den sekundären Antikörper im Sperrpuffer. Für eine Verdünnung von 1:200 995 Mikroliter Sperrpuffer zu einem 1,5 Milliliter-Rohr hinzufügen, gefolgt von fünf Mikrolitern des sekundären Antikörpers an ein und demselben Rohr. Fügen Sie den sekundären Antikörper zu allen Abschnitten, einschließlich der Steuerung, hinzu und inkubieren Sie sie für eine Stunde in einer befeuchteten Kammer, die vor Licht geschützt ist. Wenn der Timer ertönt, entfernen Sie die Folien aus dem Inkubator. Entleeren Sie den sekundären Antikörper von den Abschnitten. Sobald der sekundäre Antikörper entfernt wurde, legen Sie die Dias in ein Dia-Rack und tauchen Sie die Dias dann für 10 Minuten vollständig in 1X PBS ein, geschützt vor Licht. Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal, mit frischen 1X PBS für jede Wäsche. Fügen Sie nach dem Einwaschzwei bis drei Tropfen Montagemedien, die DAPI enthalten, zu jedem Dia hinzu und legen Sie einen Glasdeckel auf die Proben. Lassen Sie die Dias über Nacht an einem dunklen Ort trocknen, bevor Sie die Abschnitte mit einem fluoreszierenden Bereich bebildern.

Während der Bildgebung hängen die Details der Bildaufnahme vom jeweiligen Mikroskop und der verfügbaren Software ab. In diesem speziellen Beispiel jedoch die Software Leica Application Suite, Version 3. 8, wird verwendet, um die Analyse durchzuführen. Klicken Sie mit diesem Programm auf die Registerkarte "Erwerben" und aktivieren Sie im Modus Bild-Overlay-Erfassung sowohl DAPI als auch RFP. Passen Sie als Nächstes belichtung, Gain und Gamma für DAPI und RFP an, indem Sie eine Initiale mit den von der Software definierten Standardeinstellungen vornehmen und dann die Helligkeit optimieren, indem Sie die Belichtungszeit und die Verstärkung ändern, wobei zu berücksichtigen ist, dass minimale optimale Einstellungen bildsättigung und Photobleichung der Proben zu vermeiden. Gamma kann geändert werden, um dunklere Bereiche eines Bildes zu optimieren.

Sobald die Einstellungen angepasst wurden, drücken Sie die Schaltfläche Overlay erfassen, um Overlay-Bilder der DAPI- und RFP-Belichtungen zu erstellen. Dieses Mit der demonstrierten Technik aufgenommene Beispielbild zeigt einen Maus-Brusttumorabschnitt, der mit dem Antikörper F4/80 befleckt ist und ein rot dargestelltes Antigen auf Makrophagen und anderen myeloischen Zellen erkennt. Da DAPI-haltige Montagemedien verwendet wurden, werden Kerne blau dargestellt. Die Daten aus der Bildgebung liefern Informationen über die Intensität und Lokalisierung des Proteins innerhalb des Gewebeabschnitts.

Im Bild des mit F4/80 gebeizten Tumors wird beispielsweise die Zelloberflächenfärbung dieses Antigens beobachtet. Diese Daten können auch Informationen über die Häufigkeit bestimmter Zellpopulationen innerhalb des Gewebeabschnitts liefern. Dies kann quantifiziert werden, indem die Anzahl der positiv gefärbten Zellen, hier rot dargestellt, gezählt und mit der gesamten Zellpopulation verglichen wird, die blau dargestellt ist, und die Häufigkeit mit der folgenden Gleichung berechnet.

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