Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

15.14: تفاعل البوليمراز المتسلسل PCR
فهرس المحتويات

JoVE Core
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. You will only be able to see the first 20 seconds.

Education
PCR
 
نسخة طبق الأصل

15.14: تفاعل البوليمراز المتسلسل PCR

نظره عامه

تفاعل البلمرة المتسلسل ، أو PCR ، هو تقنية مستخدمة على نطاق واسع لنسخ أجزاء من الحمض النووي. بسبب التضخيم الأسي ، يمكن أن ينتج تفاعل البوليميريز المتسلسل ملايين أو مليارات من نسخ الحمض النووي في غضون ساعات قليلة. في تفاعل البوليميريز المتسلسل ، يقوم إنزيم بوليميريز الحمض النووي المقاوم للحرارة بتضخيم الحمض النووي الأصلي من خلال سلسلة من التغيرات في درجات الحرارة داخل جهاز آلي يسمى جهاز التدوير الحراري.

تفاعل البلمرة المتسلسل هو طريقة متعددة الاستخدامات أحدثت ثورة في البيولوجيا الجزيئية

طور كاري موليس تفاعل البلمرة المتسلسل في عام ١٩٨٣ ، وحصل على جائزة نوبل في الكيمياء عام ١٩٩٣. نظراً لكونه طريقة سريعة وغير مكلفة ودقيقة نسبياً لنسخ تسلسل الحمض النووي ، فقد أصبح تفاعل البلمرة المتسلسل أداة لا تقدر بثمن للعديد من التطبيقات ، بما في ذلك الاستنساخ الجزيئي ، والطفرات الجينية ، واكتشاف العوامل الممرضة ، وتحليل التعبير الجيني ، وتقدير وتسلسل الحمض النووي ، وتشخيص الأمراض الوراثية.

دورة تفاعل البلمرة المتسلسل

يحاكي تفاعل البلمرة المتسلسل عملية تكرار الحمض النووي الطبيعية التي تحدث في الخلايا. يشتمل خليط التفاعل على تسلسل نموذجي للحمض النووي ليتم نسخه ، وزوجاً من جزيئات الحمض النووي القصيرة تسمى البادئات ، وكتل بناء الحمض النووي الحر تسمى ديوكسينيوكليوتيد ثلاثي الفوسفات (dNTPs) ، وإنزيم بوليميريز الحمض النووي متخصص.

يتضمن تفاعل البلمرة المتسلسل سلسلة من الخطوات عند درجات حرارة عالية ، مما يتطلب إنزيم بوليميريز الحمض النووي الذي يعمل في درجات الحرارة هذه. يعد بوليميريز الحمض النووي الأكثر استخداماً هو بوليميريز Taq ، الذي سمي على اسم Thermus aquaticus ، البكتيريا التي تم عزل البوليميريز منها في البداية. بوليميريز الحمض النووي غير قادر على تخليق جزيء حمض نووي من نقطة الصفر أو دي نوفو. بدلاً من ذلك ، يضيف بوليميريز الحمض النووي إلى جزيئات الحمض النووي القصيرة ، المسماة البادئات ، والتي ترتبط بقالب الحمض النووي من خلال الاقتران الأساسي التكميلي. توفر البرايمر مجموعة الهيدروكسيل حرة عند النهاية 3' التي يمكن أن يعلق عليها بوليميريز الحمض النووي dNTPs الجديدة. هناك أربعة أنواع من dNTPs في تفاعل البلمرة المتسلسل ، واحد لكل نيوكليوتيد في جزيء الحمض النووي: dATP و dCTP و dGTP و dTTP.

تتكون كل دورة تفاعل بلمرة متسلسل من ثلاث خطوات: تمسخ ، تلدين ، وتخليق حمض نووي.

  1. التمسخ. تبدأ دورة تفاعل البلمرة المتسلسل بتسخين خليط التفاعل إلى درجة حرارة عالية ، مما يتسبب في فصل اللولب المزدوج للحمض النووي إلى شريطين. عملية ”الذوبان“ هذه تحدث عادة عند درجة حرارة ٩٠ درجة مئوية - ١٠٠ درجة مئوية.
  2. التلدين. يتم تبريد خليط التفاعل بسرعة (عادة إلى ٥٠ درجة مئوية - ٦٥ درجة مئوية) ، مما يسمح للاثنين من البادئات بالربط مع تسلسلهما التكميلي على خيوط الحمض النووي النموذجية.
  3. .
  4. تخليق الحمض النووي (التمديد التمهيدي). يسخن خليط التفاعل مرة أخرى ، هذه المرة إلى درجة حرارة (عادة ٦٠ درجة مئوية - ٧٥ درجة مئوية) التي تسمح لبوليميريز الحمض النووي بتمديد البادئات عن طريق إضافة dNTPs التي تقترن مع القواعد في شريط القالب.

يتضمن تفاعل البلمرة المتسلسل النموذجي ٢٠-٤٠ دورة متكررة من هذه الخطوات الثلاث ، تحدث في جهاز التدوير الحراري. نظراً لأن عدد جزيئات الحمض النووي يتضاعف في كل دورة ، يتم تضخيم الحمض النووي بشكل كبير.

قيود تفاعل البلمرة المتسلسل

إذا أراد عالم تضخيم امتداد معين للجينوم ، فيجب على العالم أن يعرف على الأقل جزءاً من تسلسل الحمض النووي المستهدف لتصميم البادئات المناسبة. هناك مشكلة أخرى محتملة تتمثل في التلدين غير المحدد لبادئات تسلسلات الحمض النووي المتشابهة جزئياً ، مما يؤدي إلى تضخيم الحمض النووي غير المستهدف. يمكن التحكم في هذه المشكلة عن طريق تحسين ظروف التفاعل. نظراً لكونه طريقة كشف شديدة الحساسية ، فإن تفاعل البلمرة المتسلسل معرض أيضاً للتلوث ، وحتى كميات ضئيلة من الحمض النووي الملوث يمكن أن تؤدي إلى نتائج مضللة. يمكن أن تكون بوليمرات الحمض النووي المستخدمة في تفاعل البلمرة المتسلسل عرضة للأخطاء. إذا حدثت طفرة خلال الدورات القليلة الأولى ، فإن معظم الحمض النووي المتضخم سيحمل الطفرة.


قراءات مُقترحة

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter