La PCR

Visión general

La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica ampliamente utilizada para fabricar copias de segmentos de ADN. Debido a la amplificación exponencial, la PCR puede producir millones o miles de millones de copias de ADN en pocas horas. En una reacción de PCR, una enzima ADN polimerasa, resistente al calor, amplifica el ADN original durante una serie de cambios de temperatura dentro de una máquina automatizada llamada termociclador.

LA PCR es un método versátil que revolucionó la biología molecular

Kary Mullis desarrolló la PCR en 1983, por lo que fue galardonado con el Premio Nobel de Química 1993. Al ser una forma relativamente rápida, económica y precisa de copiar una secuencia de ADN, la PCR se convirtió en una valiosa herramienta con numerosas aplicaciones, incluyendo la clonación molecular, la mutagénesis, la detección de patógenos, el análisis de la expresión génica, la cuantificación y secuenciación del ADN, y el diagnóstico de enfermedades genéticas.

El ciclo de reacción de la PCR

La PCR imita el proceso natural de replicación del ADN que tiene lugar en las células. La mezcla de reacción incluye una secuencia de ADN molde, un par de moléculas cortas de ADN llamadas cebadores o primers, las unidades básicas libres que se incorporan en la formación del ADN, llamados desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP), y una enzima ADN polimerasa especializada.

La PCR implica una serie de pasos a altas temperaturas, que requieren una enzima ADN polimerasa que sea funcional a tales temperaturas. La ADN polimerasa más utilizada es la polimerasa Taq llamada así por la bacteria Thermus aquaticus, en la que se aisló inicialmente esta enzima. La ADN polimerasa es incapaz de sintetizar una molécula de ADN desde cero. En su lugar, la ADN polimerasa se acopla a moléculas cortas de ADN, llamadas cebadores, que se unen al ADN molde por complementariedad de las bases. Los cebadores proporcionan un grupo hidroxilo 3′ terminal libre al que la ADN polimerasa incorpora nuevos dNTP. Hay cuatro tipos de dNTP en una PCR, correspondientes a cada nucleótido de la molécula de ADN: dATP, dCTP, dGTP y dTTP.

Cada ciclo de PCR consta de tres pasos: desnaturalización, hibridación y elongación.

1. Desnaturalización. El ciclo de PCR se inicia calentando la mezcla de reacción a alta temperatura, causando la separación de las dos hebras del ADN bicatenario. Este proceso generalmente ocurre a una temperatura de fusión de 90 ºC a 100 ºC.
2. Hibridación. La mezcla de reacción se enfría rápidamente (normalmente hasta 50 ºC – 65 ºC), lo que permite que los dos cebadores se unan a sus secuencias complementarias en las hebras del ADN molde.
3. Elongación del ADN (extensión del cebador). La mezcla de reacción se calienta de nuevo, esta vez a una temperatura de 60 ºC a 75 ºC, lo que permite que la ADN polimerasa elongue los cebadores mediante la incorporación de dNTP complementarios a las bases de la hebra molde.

Una PCR típica implica de 20 a 40 ciclos repetidos de estos tres pasos, proceso que se realiza en el termociclador. Puesto que el número de moléculas de ADN se duplica en cada ciclo, el ADN se amplifica exponencialmente.

Limitaciones de la PCR

Para amplificar un tramo específico del genoma, el científico debe conocer, al menos, parte de la secuencia de ADN diana para diseñar los cebadores apropiados. Otro potencial problema es la hibridación inespecífica de cebadores a secuencias de ADN parcialmente similares, lo que conduce a la amplificación del ADN no diana. Este problema se puede controlar optimizando las condiciones de reacción. Al ser un método de detección altamente sensible, la PCR también es vulnerable a la contaminación, e, incluso, mínimas cantidades de ADN contaminante pueden causar resultados engañosos. Las ADN polimerasas utilizadas en la PCR pueden ser propensas a errores. Si ocurre una mutación durante los primeros ciclos, la mayor parte del ADN amplificado contendrá la mutación.