PCR

Aperçu

La réaction en chaîne par polymérase, ou PCR, est une technique largement utilisée pour copier des segments d’ADN. En raison de l’amplification exponentielle, la PCR peut produire des millions ou des milliards de copies d’ADN en quelques heures. Dans une réaction PCR, une enzyme d’ADN polymérase résistante à la chaleur amplifie l’ADN d’origine par le biais d’une série de changements de température à l’intérieur d’une machine automatisée appelée thermocycleur.

La PCR est une méthode polyvalente qui a révolutionné la biologie moléculaire

Kary Mullis a mis au point la PCR en 1983, pour laquelle il a reçu le prix Nobel de chimie en 1993. Étant un moyen relativement rapide, peu coûteux et précis de copier une séquence d’ADN, la PCR est devenu un outil précieux pour de nombreuses applications, y compris le clonage moléculaire, la mutagenèse des gènes, la détection des agents pathogènes, l’analyse de l’expression génique, la mesure de la quantité d’ADN et le séquençage ainsi que le diagnostic des maladies génétiques.

Le cycle des réactions PCR

La PCR imite le processus naturel de réplication de l’ADN qui se produit dans les cellules. Le mélange réactionnel comprend une séquence d’ADN matrice à copier, une paire de courtes molécules d’ADN appelées amorces, des blocs de construction d’ADN libres appelés des désoxynucléotides triphosphates (dNTP), et une enzyme spécialisée d’ADN polymérase.

La PCR implique une série d’étapes à des températures élevées, nécessitant une enzyme d’ADN polymérase qui est fonctionnelle à de telles températures. L’ADN polymérase la plus couramment utilisée est la Taq polymérase, du nom de Thermus aquaticus, la bactérie à partir de laquelle la polymérase a été isolée initialement. L’ADN polymérase est incapable de synthétiser une molécule d’ADN à partir de zéro, ou de novo. Au lieu de cela, l’ADN polymérase ajoute aux courtes molécules d’ADN, appelées amorces, qui se lient à la matrice d’ADN par l’appariement de bases complémentaires. Les amorces fournissent un groupe hydroxyle libre en 3’ auquel l’ADN polymérase peut attacher de nouveaux dNTP. Il existe quatre types de dNTP dans une PCR, un pour chaque nucléotide dans la molécule d’ADN : dATP, dCTP, dGTP et dTTP.

Chaque cycle PCR se compose de trois étapes : la dénaturation, l’hybridation et la synthèse de l’ADN.

1. Dénaturation Le cycle PCR est initié par le chauffage du mélange réactionnel à une température élevée, provoquant la séparation de l’ADN double hélice en deux brins. Ce processus de ‘ fusion ” se produit habituellement à une température de 90 °C à 100 °C.
2. Hybridation Le mélange réactionnel est rapidement refroidi (habituellement à 50 °C–65 °C), permettant aux deux amorces de se lier à leurs séquences complémentaires sur les brins d’ADN matrice.
3. La synthèse d’ADN (l’extension d’amorce) Le mélange réactionnel est chauffé à nouveau, cette fois à une température (habituellement 60 °C–75 °C) qui permet à l’ADN polymérase d’étendre les amorces en ajoutant des dNTP qui s’associent aux bases du brin matrice.

Une PCR typique implique 20 à 40 cycles répétés de ces trois étapes, se produisant dans le thermocycleur. Puisque le nombre de molécules d’ADN est doublé à chaque cycle, l’ADN est amplifié de façon exponentielle.

Les limites de la PCR

Si le scientifique veut amplifier une portion spécifique du génome, il doit connaître au moins une partie de la séquence d’ADN cible pour concevoir des amorces appropriées. Un autre problème potentiel est l’hybridation non spécifique des amorces à des séquences d’ADN partiellement similaires, conduisant à l’amplification d’ADN non-cible. Ce problème peut être contrôlé en optimisant les conditions de réaction. Étant une méthode de détection très sensible, la PCR est également vulnérable à la contamination, et même des traces d’ADN contaminant peuvent causer des résultats trompeurs. Les polymérases d’ADN utilisées dans la PCR peuvent être sujettes à des erreurs. Si une mutation se produit dans les premiers cycles, la plupart de l’ADN amplifié portera la mutation.