PCR

Overzicht

De polymerasekettingreactie, of PCR, is een veelgebruikte techniek voor het kopiëren van DNA-segmenten. Dankzij exponentiële amplificatie kan PCR binnen enkele uren miljoenen of miljarden DNA-kopieën produceren. In een PCR-reactie verdubbelt een hittebestendig DNA-polymerase-enzym het oorspronkelijke DNA door een reeks temperatuurveranderingen in een geautomatiseerde machine, een thermocycler genaamd.

PCR is een veelzijdige methode die een revolutie teweeg heeft gebracht in de moleculaire biologie

Kary Mullis ontwikkelde PCR in 1983, waarvoor hij in 1993 de Nobelprijs voor de scheikunde ontving. Omdat het een relatief snelle, goedkope en nauwkeurige manier is om een DNA-sequentie te kopiëren, werd PCR een hulpmiddel van onschatbare waarde voor tal van toepassingen, waaronder moleculair klonen, genmutagenese, detectie van pathogenen, analyse van genexpressie, DNA-kwantificering en sequentiebepaling, en diagnose van genetische ziekten.

De PCR-reactiecyclus

PCR bootst het natuurlijke DNA-replicatieproces na dat plaatsvindt in cellen. Her reactie mengsel bevat een te kopiëren template-DNA-sequentie, een paar korte DNA-moleculen genaamd primers, vrije DNA-bouwstenen genaamd deoxynucleotide-trifosfaten (dNTP's) en een gespecialiseerd DNA-polymerase-enzym.

PCR omvat een reeks stappen bij hoge temperaturen, waarvoor een DNA-polymerase-enzym nodig is dat bij dergelijke temperaturen functioneel is. Het meest gebruikte DNA-polymerase is Taq- polymerase, genoemd naar Thermus aquaticus , de bacterie waaruit het polymerase aanvankelijk werd geïsoleerd. DNA-polymerase is niet in staat om een DNA-molecuul helemaal opnieuw te synthetiseren, of de novo. In plaats daarvan wordt de DNA-polymerase toegevoegd aan korte DNA-moleculen, primers genaamd, die door complementaire basenparing aan het DNA-template zijn gebonden. De primers zorgen voor een vrije 3'-hydroxylgroep waaraan DNA-polymerase nieuwe dNTP's kan binden. Er zijn vier soorten dNTP's in een PCR, één voor elke nucleotide in het DNA-molecuul: dATP, dCTP, dGTP en dTTP.

Elke PCR-cyclus bestaat uit drie stappen: denaturatie, hybridisatie en DNA-synthese.

1. Denaturatie. De PCR-cyclus wordt gestart door het reactiemengsel op hoge temperatuur te verwarmen, waardoor de dubbele DNA-helix in twee strengen wordt gescheiden. Dit “smelt” -proces vindt meestal plaats bij een temperatuur van 90 ° C – 100 ° C.
2. Hybridisatie. Het reactiemengsel wordt snel afgekoeld (gewoonlijk tot 50 °C-65 ° C), waardoor de twee primers kunnen binden aan hun complementaire sequenties op de template-DNA-strengen.
3. DNA-synthese (primerextensie). Het reactiemengsel wordt opnieuw verwarmd, dit keer tot een temperatuur (meestal 60 ° C-75 ° C) waardoor DNA-polymerase de primers kan verlengen door dNTP's toe te voegen die een paar vormen met de basen in de templatestreng.

Deze drie stappen worden bij een typische PCR ongeveer 20-40 keer herhaald en vinden plaats de thermocycler. Omdat het aantal DNA-moleculen in elke cyclus wordt verdubbeld, wordt het DNA exponentieel geamplificeerd.

Beperkingen van PCR </ h4>

Als de wetenschapper een specifiek deel van het genoom wil versterken, moet de wetenschapper ten minste een deel van de doelwit-DNA-sequentie kennen om geschikte primers te ontwerpen. Een ander mogelijk probleem is de niet-specifieke versmelting van primers met gedeeltelijk vergelijkbare DNA-sequenties, wat leidt tot amplificatie van niet-doelwit-DNA. Dit probleem kan worden beheerst door de reactieomstandigheden te optimaliseren. Omdat PCR een zeer gevoelige detectiemethode is, is het ook kwetsbaar voor besmetting, en zelfs sporen van verontreinigend DNA kunnen misleidende resultaten opleveren. De DNA-polymerasen die bij PCR worden gebruikt, kunnen vatbaar zijn voor fouten. Als er een mutatie optreedt binnen de eerste paar cycli, zal het meeste van het geamplificeerde DNA de mutatie dragen.