Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

15.14: PCR
TABLE OF
CONTENTS

JoVE Core
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. You will only be able to see the first 20 seconds.

Education
PCR
 
TRANSCRIPT

15.14: PCR

15.14: PCR

Overview

The polymerase chain reaction, or PCR, is a widely used technique for copying segments of DNA. Due to exponential amplification, PCR can produce millions or billions of DNA copies within just a few hours. In a PCR reaction, a heat-resistant DNA polymerase enzyme amplifies the original DNA through a series of temperature changes inside an automated machine called a thermocycler.

PCR is a Versatile Method that Revolutionized Molecular Biology

Kary Mullis developed PCR in 1983, for which he was awarded the 1993 Nobel Prize in Chemistry. Being a relatively fast, inexpensive, and precise way of copying a DNA sequence, PCR became an invaluable tool for numerous applications, including molecular cloning, gene mutagenesis, pathogen detection, gene expression analysis, DNA quantitation and sequencing, and genetic disease diagnosis.

The PCR Reaction Cycle

PCR mimics the natural DNA replication process that occurs in cells. The reaction mixture includes a template DNA sequence to be copied, a pair of short DNA molecules called primers, free DNA building blocks called deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), and a specialized DNA polymerase enzyme.

PCR involves a series of steps at high temperatures, requiring a DNA polymerase enzyme that is functional at such temperatures. The most commonly used DNA polymerase is Taq polymerase, named after Thermus aquaticus, the bacterium from which the polymerase was initially isolated. DNA polymerase is unable to synthesize a DNA molecule from scratch, or de novo. Instead, DNA polymerase adds to short DNA molecules, called primers, which bind to the DNA template through complementary base pairing. The primers provide a free 3’ hydroxyl group to which DNA polymerase can attach new dNTPs. There are four types of dNTPs in a PCR, one for each nucleotide in the DNA molecule: dATP, dCTP, dGTP, and dTTP.

Each PCR cycle consists of three steps: Denaturation, Annealing, and DNA Synthesis.

  1. Denaturation. The PCR cycle is initiated by heating the reaction mixture to a high temperature, causing separation of the DNA double helix into two strands. This “melting” process usually occurs at a temperature of 90°C­­–100°C.
  2. Annealing. The reaction mixture is quickly cooled (usually to 50°C–65°C), allowing the two primers to bind to their complementary sequences on the template DNA strands.
  3. DNA Synthesis (Primer Extension). The reaction mixture is heated again, this time to a temperature (usually 60°C–75°C) that allows DNA polymerase to extend the primers by adding dNTPs that pair with the bases in the template strand.

A typical PCR involves 20-40 repeated cycles of these three steps, occurring in the thermocycler. Since the number of DNA molecules is doubled in each cycle, the DNA is amplified exponentially.

Limitations of PCR

If the scientist wants to amplify a specific stretch of the genome, the scientist must know at least part of the target DNA sequence to design appropriate primers. Another potential issue is the nonspecific annealing of primers to partially similar DNA sequences, leading to amplification of non-target DNA. This issue can be controlled by optimizing the reaction conditions. Being a highly sensitive detection method, PCR is also vulnerable to contamination, and even trace amounts of contaminating DNA can cause misleading results. The DNA polymerases used in PCR can be prone to errors. If a mutation happens within the first few cycles, most of the amplified DNA will carry the mutation.

Genel bakış

Polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR, DNA segmentlerini kopyalamak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Üstel amplifikasyon nedeniyle, PCR sadece birkaç saat içinde milyonlarca veya milyarlarca DNA kopyaüretebilir. Bir PCR reaksiyonunda, ısıya dayanıklı bir DNA polimeraz enzimi, termocycler adı verilen otomatik bir makinenin içindeki bir dizi sıcaklık değişimi yle orijinal DNA'yı güçlendirir.

PCR Moleküler Biyolojide Devrim Yapan Çok Yönlü Bir Yöntemdir

Kary Mullis 1983 yılında PCR'yi geliştirdi ve 1993 yılında Nobel Kimya Ödülü'ne layık görüldü. Bir DNA dizisini kopyalamanın nispeten hızlı, ucuz ve hassas bir yolu olan PCR, moleküler klonlama, gen mutagenezi, patojen tespiti, gen ekspresyonu analizi, DNA kantitasyonu ve dizilemesi ve genetik hastalık tanısı gibi çok sayıda uygulama için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir.

PCR Reaksiyon Döngüsü

PCR hücrelerde oluşan doğal DNA çoğaltma işlemini taklit eder. Reaksiyon karışımı kopyalanacak bir şablon DNA dizisi, astar adı verilen bir çift kısa DNA molekülü, deoksinükleotid trifosfat (dNTP) adı verilen serbest DNA yapı taşları ve özel bir DNA polimeraz enzimi içerir.

PCR yüksek sıcaklıklarda bir dizi adım içerir, bu tür sıcaklıklarda işlevsel bir DNA polimeraz enzim gerektiren. En sık kullanılan DNA polimeraz Taq polimeraz, Thermus aquaticusadını , polimeraz başlangıçta izole edildi bakteri. DNA polimeraz bir DNA molekülünü sıfırdan sentezleyemiyor, ya da de novo. Bunun yerine, DNA polimeraz kısa DNA molekülleri ekler, astar denilen, tamamlayıcı baz eşleştirme yoluyla DNA şablonuna bağlamak. Astarlar, DNA polimerazın yeni dNTP'ler takabileceği 3' hidroksil grubu sağlar. Bir PCR'de dört tip dNTP vardır, DNA molekülündeki her nükleotit için bir tane: dATP, dCTP, dGTP ve dTTP.

Her PCR döngüsü üç adımdan oluşur: Denatürasyon, Annealing ve DNA Sentezi.

  1. Denatürasyon. PCR döngüsü, reaksiyon karışımının yüksek bir sıcaklığa ısıtılmasıyla başlatılır ve DNA çift sarkının iki iplikçik halinde ayrılmasına neden olur. Bu "erime" işlemi genellikle 90°C-100°C sıcaklıkta gerçekleşir.
  2. Tavlama. Reaksiyon karışımı hızlı bir şekilde soğutularak (genellikle 50°C-65°C'ye kadar), iki astarın şablon DNA iplikçiklerindeki tamamlayıcı dizilerine bağlanmasını sağlar.
  3. DNA Sentezi (Primer Uzantısı). Reaksiyon karışımı bu kez tekrar ısıtılır, bu kez DNA polimerazın şablon iplikçikteki bazlarla eşleşen dNTP'ler ekleyerek astarları genişletmesini sağlayan bir sıcaklığa (genellikle 60°C-75°C) kadar.

Tipik bir PCR termocycler meydana gelen bu üç adım, 20-40 tekrarlanan döngüleri içerir. DNA moleküllerinin sayısı her döngüde iki katına çıktığı için, DNA katlanarak yükseltilir.

PCR sınırlamaları

Eğer bilim adamı genomun belirli bir bölümünü güçlendirmek istiyorsa, bilim adamı uygun astarları tasarlamak için hedef DNA dizisinin en azından bir kısmını bilmelidir. Bir diğer potansiyel sorun da astarların kısmen benzer DNA dizilerine özgü olmayan annelikleri dir. Bu sorun, reaksiyon koşulları optimize edilerek kontrol edilebilir. Son derece hassas bir algılama yöntemi olan PCR, kontaminasyona karşı da savunmasızdır ve dna'nın kirlenmesi bile yanıltıcı sonuçlara neden olabilir. PCR'de kullanılan DNA polimerazlar hatalara yatkın olabilir. Eğer bir mutasyon ilk birkaç döngü içinde gerçekleşirse, güçlendirilmiş DNA'nın çoğu mutasyonu taşıyacaktır.


Suggested Reading

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter