Introducción para el espectrofotómetro

General Laboratory Techniques

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Summary

El espectrofotómetro es un instrumento utilizado rutinariamente en la investigación científica. Espectrofotometría es la medición cuantitativa de la cantidad de una sustancia química absorbe la luz al pasar un haz de luz a través de la muestra usando un espectrofotómetro. En este vídeo se repasan los conceptos básicos de la espectrofotometría, como transmitancia, absorbancia y la ley de Beer-Lambert además de los componentes del espectrofotómetro. Estos conceptos constituyen una base para saber cómo determinar la concentración de un soluto en solución que es capaz de absorber luz en el rango ULTRAVIOLETA y visible. Además, se demuestra un procedimiento de cómo operar el espectrofotómetro, incluyendo instrucciones sobre cómo blanco y medir la absorbancia de una muestra a la longitud de onda deseada. El video incluye también cómo hacer una curva estándar para la determinación de la concentración de analito. Se discuten las varias aplicaciones del espectrofotómetro en la investigación biológica, tales como medición de la densidad celular y la determinación de las tasas de reacción química. Por último, se introduce el espectrofotómetro microvolume, así como su ventaja en la medición de la calidad y cantidad de proteínas y ácidos nucleicos.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Técnicas generales de laboratorio. Introducción para el espectrofotómetro. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

El espectrofotómetro es un instrumento ubicuo usado en la investigación biológica, química, clínica y ambiental.

Espectrofotometría es la medición cuantitativa de la cantidad de una sustancia química absorbe la luz al pasar un haz de luz a través de la muestra usando un espectrofotómetro.

Midiendo la intensidad de luz detectada, este método puede utilizarse para determinar la concentración de soluto en la muestra.

El haz de luz que se irradia hacia la muestra está conformado por una corriente de fotones.

Cuando fotones encuentran las moléculas en la muestra, las moléculas pueden absorber algunos de ellos, reduciendo el número de fotones en el haz de luz y disminuyendo la intensidad de la señal detectada.

Transmitancia es la fracción de luz que pasa a través de la muestra y se define como la intensidad de luz que pasa a través de la muestra sobre la intensidad de luz incidente. Absorbancia es el logaritmo inverso de la transmitancia y la cantidad de que su espectrofotómetro medirá.

De la absorbancia, la concentración de la solución de la muestra puede determinarse de la ley de Beer-Lambert, que establece que existe una relación lineal entre la absorbancia y la concentración de una muestra. Según la ley de Beer-Lambert, la absorbancia es el producto del coeficiente de extinción, una medida de cómo fuertemente un solute absorbe la luz en una longitud de onda dada, la longitud de la luz que pasa a través de la muestra, o la longitud de ruta y la concentración de soluto. A menudo, el objetivo de tomar mediciones de absorbancia es medir la concentración de una muestra.

Cada espectrofotómetro incluye una fuente de luz, un colimador, que es una lente o dispositivo de enfoque que transmite un intenso haz recto de la luz, un monocromador para separar el haz de luz en sus longitudes de onda componentes y un selector de longitud de onda o raja, para selección de la longitud de onda deseada. Las longitudes de onda de luz utilizada en espectrofotómetros discutidas en este video están en el rango ULTRAVIOLETA y visible. El espectrofotómetro también incluye a algún tipo de sostenedor de la muestra, un detector fotoeléctrico, que detecta la cantidad de fotones que son absorbidos, y una pantalla para mostrar la salida del detector.

Nuevos espectrofotómetros están acoplados directamente a un ordenador, donde pueden controlar los parámetros del experimento y los resultados se muestran.

Al realizar la espectrofotometría, asegúrese de tomar las precauciones apropiadas, tales como guantes, dependiendo del tipo de soluciones biológicas o químicas que está trabajando.

Antes de medir el espectro UV-visible de una muestra, encienda la máquina y permita que las lámparas y electrónica para calentar.

Preparar un blanco de la misma solución pero sin analito, tener el mismo pH y fuerza iónica similar; un paso necesario como la célula y el solvente puede dispersar la luz.

Portamuestras del espectrofotómetro tradicionales están diseñadas para contener cubetas de plástico y cuarzo. Proceder a pipetear la solución en blanco en la cubeta.

Después de limpiar las huellas dactilares y los derrames fuera de la cubeta, correctamente insertar la cubeta en el soporte de muestra y cerrar la puerta del compartimiento de la cubeta.

Nunca olvide cerrar la puerta ya que la radiación UV emitida por un espectrofotómetro abierto puede dañar los ojos y la piel.

Establecer la longitud de onda deseada o el rango de longitud de onda a transmitir en la muestra, que depende de la longitud de onda óptima de la luz que absorbe el analito. Entonces, cero del instrumento tomando una lectura del espacio en blanco, que se restará al fondo de su tampón.

Dependiendo del tipo de experimento espectrofotométrico que está realizando, puede ser necesario generar una curva estándar antes de la medición de la muestra, de que la concentración de analito de la muestra puede finalmente determinarse.

Permita que la muestra alcance la temperatura adecuada y mezclar suavemente, para que no se introduzcan burbujas. La muestra les puede añadirse directamente a la cubeta, en el instrumento y una lectura tomada.

Después de realizar la medida de absorbancia de la muestra, proceder al cálculo adecuado para su experimento; por ejemplo determinación de la concentración o la tasa de actividad de la enzima.

El espectrofotómetro se usa a diario en muchos laboratorios de investigación biológica.

Una aplicación común del espectrofotómetro es la medición de la densidad celular. Medida de la densidad celular es útil en la generación de las curvas de crecimiento logarítmico de las bacterias, de la cual se puede determinar el momento óptimo para la inducción de proteína recombinante.

El espectrofotómetro puede utilizarse también para medir las tasas de reacción química. En este ejemplo, absorbancia se utiliza para controlar una reacción enzimática por la desaparición de una reacción intermedia en 452 nm con el tiempo. La tasa de este paso enzimático puede ser calculada ajustando los datos a la ecuación correspondiente.

Recientemente, la introducción de micro volumen espectrofotómetros ha eliminado la necesidad de que los titulares de la muestra. Estos espectrofotómetros utilizan tensión superficial para mantener la muestra.

Spectrophometers micro-volumen son óptimos para medir la calidad y concentración de muestras caras de volumen limitado, como biomoléculas, como proteínas y ácidos nucleicos.

La absorción de proteínas a 280 nm depende del contenido de cadenas laterales aromáticas en triptófano, tirosina, fenilalanina, así como la existencia de enlaces de disulfuro de cisteína-cisteína.

Concentración de proteína puede ser determinada de su absorbancia a 280 nm y su coeficiente de extinción, que se basa en la composición de aminoácidos.

ADN y ARN tienen un máximo de absorbancia a 260 nm que puede determinarse su concentración. La pureza del ácido nucleico puede ser evaluada también la relación de lecturas de absorbancia a longitudes de onda específicas.

Sólo ha visto introducción de Zeus en el espectrofotómetro.

En este video repasamos algunos principios básicos, incluyendo conceptos de Espectrofotometría y componentes del espectrofotómetro. También demostró paso a paso operación del espectrofotómetro y discute su uso en la investigación biológica. Gracias por ver.

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