Electroporación de murino en el útero

Neuroscience

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Summary

En el útero la electroporación es una técnica importante para el estudio de los mecanismos moleculares que dirigen la proliferación, diferenciación, migración y maduración de las células durante el desarrollo neural. La electroporación permite la entrega rápida y específica del material en las células mediante la utilización de pulsos eléctricos para crear transitorios poros en las membranas celulares. Aunque la electroporación se ha utilizado tradicionalmente en estudios en vitro , los avances científicos ahora han ampliado su utilización a los órganos intactos, tales como aquellas encontradas en embriones de ratón en desarrollo en el útero.

Este video presenta los principios fundamentales detrás de electroporación en el útero además de revisar las técnicas quirúrgicas básicas necesarias para acceder a los embriones en desarrollo dentro de un roedor embarazado. Detalles de los pasos de inyección y la electroporación se proporcionan junto con consideraciones importantes para dirigir la entrega del gene a regiones específicas del cerebro. Finalmente, se presentan aplicaciones neurobiológicas de la electroporación en el útero , tales como investigar cómo determinados genes contribuyen al desarrollo neuronal y cómo forman conexiones entre el desarrollo de las neuronas.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la Neurociencia. Electroporación de murino en el útero. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

En el útero la electroporación es una técnica clave para el estudio de los mecanismos moleculares que guían el desarrollo neurológico. Mediante la inyección de ADN para alterar la expresión génica en regiones específicas del cerebro de roedor en vías de desarrollo, los investigadores pueden estudiar la proliferación, diferenciación, migración y maduración de las células neurales en el contexto de su ambiente natural.

Este video presenta los principios fundamentales detrás de en el útero la electroporación, una descripción básica sobre cómo realizar la técnica y sus aplicaciones en Neurobiología de investigación.

Antes que profundizar en cómo se realiza este procedimiento, permite primero sobre algunos principios de la electroporación. Este procedimiento utiliza impulsos eléctricos que crean transitorios poros en las membranas celulares, permitiendo que la DNA para entrar en la célula. Puesto que el ADN cargado negativamente se mueve hacia el electrodo positivo, pueden orientarse hacia diferentes poblaciones celulares dependiendo de la colocación del campo eléctrico.

Aunque la electroporación se ha utilizado tradicionalmente en estudios en vitro , los avances científicos han ampliado su utilización a los órganos intactos, los que se encuentran en embriones de ratón en desarrollo en el úteroincluyendo.

Electroporación en el útero, a diferencia de la célula cultura o ex vivo las técnicas, tiene la ventaja de que las células transfected seguirá expuesto a todas las señales fisiológicas que guían el desarrollo normal. Esto es particularmente importante en el cerebro, donde las estructuras tales como axones requieren señales de orientación de otros tipos de células con el fin de desarrollar adecuadamente.

Desarrollo del cerebro en particular consiste en una serie programada de proliferación y eventos de migración, lo que significa que pueden orientarse hacia capas diferentes de tejido basan en la sincronización de la electroporación.

Por último, la disponibilidad de diferentes tipos de electrodos permite a los investigadores acceder a ambas regiones cerca de la superficie del cerebro, así como áreas más profundas. Electrodos de paleta se utilizan cuando partes superficiales del cerebro, tales como la corteza y el hipocampo, mientras que se utilizan pequeños electrodos de aguja dirigida a estructuras profundas como el tálamo y el hipotálamo.

Ahora que hemos discutido algunos principios básicos detrás de la técnica, permite obtener los preparativos del camino así que nos podemos adentrar en la electroporación quirúrgica del procedimiento y en el útero .

En primer lugar, esterilizar todos los instrumentos y limpiar la zona quirúrgica con etanol al 70%. A continuación, preparar una solución de inyección mediante la disolución de la DNA del plasmid en PBS estéril que contiene 0.1% rápido verde. El verde rápido se agrega para permitir la visualización de la solución de la inyección en el embrión. Por último, utilizar un extractor de aguja, una aguja ultra fina debe crearse para reducir la pérdida de líquido amniótico y la subsecuente mortalidad fetal.

Ahora que ya tenemos todo preparado, van sobre los pasos básicos para el tejido de cerebro de electroporating en el desarrollo de roedores. Empezar por anestesiar una presa embarazada utilizando 5% isoflurano luego transferirla a un tubo respirador entrega de isoflurano de 2,25% para la totalidad del procedimiento. A continuación, para el alivio del dolor postoperatorio, entregar un analgésico como la buprenorfina por vía subcutánea. Afeitar el abdomen y esterilizar el sitio de la incisión.

Exponer quirúrgicamente el útero, haga una incisión vertical a lo largo de la línea media en la piel y con unas tijeras, corte a través del peritoneo. Para evitar que los embriones se secar, cubrir la abertura con una gasa empapada solución salina estéril. A continuación, tire suavemente de la cadena embrionaria fuera de la cavidad abdominal, asegurándose de mantener los embriones húmeda cubriéndola con solución salina estéril precalentada.

Con un microscopio de disección, identificar embriones bien colocados para facilitar el acceso al cerebro. Usando sus dedos o pinzas estabilizar la cabeza del embrión e inyecte la solución de ADN a través de la pared uterina y en el cerebro. Colocar un electrodo en cada lado de la cabeza, con el electrodo positivo en la dirección que desea la electroporated de ADN. Una vez que todos los embriones apropiadamente colocados electroporated, coloque con cuidado el cuerno uterino hacia la cavidad abdominal.

Antes de cerrar la incisión, añadir 2-3 ml de solución salina tibia a la cavidad. Cose el peritoneo junto con suturas absorbibles, y cerrar la piel con grapas. Por último, transferir el ratón a una jaula con una almohada y un monitor.

Ahora que hemos pasado sobre cómo llevar a cabo en el útero de electroporación, examinemos algunas aplicaciones posteriores de esta técnica.

En el útero la electroporación es una herramienta útil para investigar cómo determinados genes contribuyen al desarrollo neuronal. Electroporated construcciones pueden guiar la sobreexpresión de proteínas tipo salvaje o mutante o bloquear totalmente la expresión de la proteína. Fenotipos neurológicos entonces pueden ser evaluados a nivel microscópico u organismo. Por ejemplo, estos experimentadores determinaron que la sobreexpresión transitoria del gene asociada a esquizofrenia, DISC-1 en el cerebro de ratón en desarrollo, dio lugar a hipersensibilidad a anfetamina más adelante en vida.

Electroporación en el útero también puede ser útil para la visualización de poblaciones celulares específicas y las conexiones que hacen mediante la entrega de secuencias que codifican las proteínas fluorescentes en tejido nervioso. Por ejemplo, los experimentadores electroporated el gen de la proteína verde fluorescente en retinas E13.5 para estudiar las células ganglionares de la retina o RGCs, que transmiten información visual del ojo al cerebro. Examen de retina en E18.5 muestra cómo esta técnica puede utilizarse para rastrear la ruta del axón leve a través del nervio óptico, quiasma y tracto óptico.

Por último, muchos acontecimientos importantes en el desarrollo neuronal ocurren después del nacimiento, inspirando a los científicos a desarrollar una técnica modificada llamada electroporación en vivo . Este procedimiento sigue los mismos pasos básicos como electroporación en el útero , pero generalmente se realiza dentro de los primeros días después del nacimiento. Manipulación genética postnatal es particularmente útil para el estudio de tipos de la célula llevado más adelante, como las que se encuentran en el bulbo olfatorio que se muestra a continuación.

Sólo ha visto video en el útero de electroporación de Zeus. Este video contiene principios clave y una descripción básica sobre cómo realizar electroporación en el útero , así como algunas aplicaciones posteriores que permiten investigar los mecanismos moleculares neurodesarrollo de guía.

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