Génotypage SNP

Genetics

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Summary

Polymorphismes mononucléotidiques ou SNP, est la forme la plus courante de la variation génétique chez les humains. Souvent, ces différences dans les différentes bases dans l’ADN ne touchent pas directement l’expression des gènes, mais dans de nombreux cas peuvent toujours être utiles pour localiser les gènes associés à la maladie ou pour diagnostiquer les patients. Nombreuses méthodologies ont été établis pour identifier, ou « génotype », SNP.

Introduction de JoVE de génotypage SNP commence par discuter de ce que le SNP est et comment ils peuvent servir à identifier les gènes associés à la maladie. Plusieurs méthodes communes de génotypage SNP sont ensuite examinés, y compris hybridation directe, méthodes basées sur la PCR, analyse de fragment et le séquençage. Enfin, nous présentons plusieurs exemples de comment ces techniques sont appliquées à la recherche génétique aujourd'hui.

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JoVE Science Education Database. Genetics. Génotypage SNP. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

La variation génétique se produit au sein et entre les différentes populations, et elle contribue à la variation des caractères, y compris la susceptibilité à la maladie, chez les individus. Les variations plus courantes sont les polymorphismes mononucléotidiques ou SNP. SNP génotypage consiste à déterminer les ensembles spécifiques de variantes, dans ce cas, SNP, présenter chez un individu.

Cette vidéo va discuter de certains des principes derrière le génotypage SNP, donner une introduction à plusieurs méthodes d’identification communs SNP et enfin, certaines applications de ces techniques.

Tout d’abord, nous allons discuter de ce qui est un SNP et comment il peut être utilisé dans le génotypage.

« Polymorphisme » est des allèles, ou des versions différentes d’un locus génétique, à une fréquence appréciable au sein d’une population et comprendre des substitutions de base ainsi que les insertions ou les suppressions. Polymorphismes sont des variations sur une seule base de l’ADN. SNP peut survenir tout au long de l’ensemble du génome, et la plupart ne modifie pas la structure ou gene expression de la protéine. Toutefois, ils peuvent encore être associés à des maladies en raison de leur proximité physique ou « lien » vers un variant génétique qui causent des maladies. En revanche, il y a plusieurs SNP éminents qui est connus pour être directement responsable de maladies comme la mucoviscidose, l’anémie falciforme et β-thalassémie.

Une application pratique pour le génotypage SNP est une médecine personnalisée, où l’identification des SNP qui sont associées à des maladies, ou avec des réactions différentes à un médicament ou une thérapie, peut aider les médecins à mieux diagnostiquer et traiter les patients.

SNP est également utiles pour les études de liaison pangénomique, qui examiner des centaines de milliers de SNP au sein du génome entier d’identifier celles qui sont associées à des traits ou des maladies. GWAS tire parti des groupes de SNP connu comme « haplotypes. » SNP au sein d’un haplotype est dans « un déséquilibre de liaison, » ce qui signifie que la combinaison particulière des variantes sont plus susceptibles de se produire ensemble que prévu par hasard, souvent le résultat de leur proximité physique sur un chromosome. Cela signifie que les haplotypes peuvent être différenciés par génotypage, seul un petit nombre de SNP individuels, faisant la liaison génétique études moins coût - ou fastidieuses.

Après avoir regardé ce que le SNP est et comment ils peuvent être utilisés, Let ' s go à travers plusieurs des nombreuses méthodes qui ont été développés au génotype SNP. Il s’agit de l’hybridation directe, méthodes basées sur la PCR, analyse de fragment et séquençage.

Techniques d’hybridation directe comme tableaux SNP utilisent des sondes oligonucléotidiques court pour identifier les SNP individuels directement. Des centaines de milliers de SNP peuvent être testés sur une biopuce unique. Les sondes sont fixés chimiquement la matrice de la puce, généralement une lame de verre. Pour détecter les SNP dans un échantillon, ADN génomique isolé est amplifié par PCR et fragmentée pour améliorer la liaison sonde efficacité. L’ADN est ensuite marqué, généralement avec un marqueur fluorescent, suivi par l’hybridation à la puce. Après que l’ADN de l’échantillon n’est autorisée à lier les sondes, tous les ADN non lié ou non spécifiquement liée est rongée. En mesurant le signal à chaque endroit de la sonde, la présence de l’allèle de la cible dans l’échantillon peut être déterminée.

Une autre méthode de typage SNP est PCR allèle spécifique, où les amorces sont conçus contre des séquences contenant des SNP afin qu’ils seulement s’hybrident à l’allèle parfaitement complémentaire. Les produits PCR peuvent être détectés par des méthodes telles que les balises fluorescentes. Alternativement, des amorces PCR flanquant le site SNP d’intérêt peuvent être conçus en collaboration avec une sonde SNP spécifiques comme le test TaqMan PCR. Ici, la sonde est dotée d’un marqueur fluorescent, ainsi qu’une molécule d’extincteur qui supprime la fluorescence du marqueur à proximité. Au cours de la PCR, seule la séquence de la sonde spécifiquement liée devrait être dégradée par l’activité d’exonucléase 5′ de la polymérase, qui la sépare de la balise fluorescente de l’extincteur et résultant en un signal fluorescent qui indique la présence de la variante particulière.

Une troisième catégorie de méthodes, appelées analyse de fragment, implique la création de fragments d’ADN de différentes tailles ou étiquettes, fondées sur la présence ou l’absence d’un SNP particulière. Analyse de polymorphisme de longueur de fragment de restriction tire parti de la spécificité stricte des endonucléases de restriction pour leur séquence cible, où un allèle est clivé et l’autre ne l’est pas. La ligature repose sur deux sondes situées juste à côté de l’autre, dont se termine à la cible SNP régions. Si la sonde contenant du SNP se lie parfaitement, la ligature peut se produire. Test d’extension amorce implique des amorces qui lient un nucléotide cible du SNP. Cette amorce est alors variablement étendue basé sur l’allèle individuel présent. Les fragments générés par ces méthodes peuvent alors être différenciés utilisant gel électrophorèse capillaire ou spectrométrie de masse.

Enfin, le séquençage peut détecter très précisément les SNP, ainsi qu’identifier roman SNP avec séquences inconnues. Cependant, des précautions supplémentaires et des répliques expérimentales supplémentaires sont effectués pour distinguer le SNP réelle du séquençage des erreurs de lecture. Comme technologies de séquençage deviennent moins chères et plus accessibles, les chercheurs utilisent plus séquençage pour le génotypage.

Après avoir vu comment les SNPs peuvent être génotypés, regardons certaines applications spécifiques pour ces techniques.

Génotypage permet de distinguer les variétés d’une espèce avec une apparence presque identique. Ceci est accompli en premier isolement ADN génomique, suivi par PCR avec des amorces conçues pour lier des séquences avec le SNP connus ou d’autres variantes génétiques. Ces amorces vont seulement amplifier l’ADN de la variété contenant le polymorphisme spécifique et peuvent ainsi être utilisés pour distinguer ces sosies.

Les chercheurs utilisent aussi génotypage pour identifier pathogènes bactéries porteuses de mutations de résistance aux médicaments spécifiques. Un protocole de matrice simplifié SNP pour milieux est établi en ajoutant génomique ADN et PCR master-mix directement à une puce. Hybridation et l’amplification de l’échantillon se produisent en une seule étape. Les baies sont ensuite lavées, imagé, et les résultats sont analysés afin de déterminer la présence ou l’absence de bactéries de la tuberculose, ainsi que les mutations résistantes aux médicaments.

Enfin, le SNP peut être utilisé pour évaluer la fonction des variantes génétiques trouvés pour augmenter le risque de la maladie par des études de l’association. Ici, les scientifiques expérimentèrent avec une lignée cellulaire qui est hétérozygote pour un neutre « marqueur » SNP située dans la portion transcrite d’un gène d’intérêt, mais aussi un test d’untranscribed SNP qui est associés à la maladie. Une lignée de cellules de contrôle négatif est choisie qui est hétérozygote pour les marqueurs SNP, mais homozygotes pour la variante associée non-maladie de l’essai de SNP. Extension d’amorce de l’allèle spécifique a été réalisée sur l’ADN génomique, ainsi que cDNA inverse transcrit à partir des ARNm exprimée. Produits d’extension de l’amorce étaient ensuite dosés par spectrométrie de masse MALDI-TOF. En comparant l’abondance relative des fragments associé d’allèles SNP deux marqueurs, les chercheurs peuvent déterminer si le SNP associés à la maladie se traduit par l’expression des gènes réduite.

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE le génotypage SNP. Cette vidéo présente le concept et les utilisations du SNP, plusieurs méthodes de base utilisées pour identifier et caractériser les SNP et mis en évidence trois demandes de génotypage SNP. Comme toujours, Merci pour regarder !

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