Resonancia de plasmón superficial (SPR)

Biochemistry

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Summary

Resonancia de plasmón superficial (SPR) es el fenómeno óptico subyacente detrás de etiqueta-libre biosensores para evaluar la afinidad molecular, cinética, especificidad y concentración de biomoléculas. En SPR, las interacciones biomoleculares se producen en un biosensor de una fina capa de metal sobre un prisma. Interacciones en tiempo real de biomoléculas pueden controlarse mediante la medición de los cambios de la luz reflejada de la parte inferior de la metal

Este video describe los conceptos básicos de SPR y cómo se utiliza para analizar y visualizar las interacciones biomoleculares. Esto es seguido por una preparación de muestras y el protocolo experimental para la investigación de tipos de enlace utilizando SPR. En la sección de aplicaciones, imágenes de SPR, SPR localizada y punto cuántico se exploran mejor SPR.

superficie

resonancia de plasmones o SPR, es el fenómeno subyacente detrás de ciertos biosensores etiqueta-libre para evaluar las interacciones vinculantes y adsorción de las biomoléculas. Ensayos de Unión que requieren etiquetado, como ELISA, pueden ser un proceso desperdiciador de tiempo y pueden alterar la funcionalidad del analito. En SPR, las interacciones biomoleculares ocurren en un sensor especial hecho de una fina capa de metal en una cara de un prisma. Monitoreo de los cambios en la luz reflejada apagado de la parte inferior del metal, instrumentos SPR visualizar estas interacciones en tiempo real sin el uso de etiquetas. Este video presenta los principios de la SPR, un procedimiento general para la proyección de imagen de SPR y algunas aplicaciones de la bioquímica.

sensor de un SPR de

se hace generalmente de una capa delgada de un metal noble en la cima de la cara de un prisma. Para tomar las lecturas del sensor, la luz se refleja fuera de la interfaz de prisma de metal en un fotodetector. La luz reflejada tendrá una intensidad alta excepto en un determinado ángulo, relacionadas con las propiedades electrónicas de la superficie del metal, conocido como el " ángulo de resonancia de plasmón superficial ".

Como las moléculas se unen a la superficie, cambian las propiedades electrónicas del metal, que a su vez ajusta el ángulo. Como colocar nuevas proteínas, formando complejos, el ángulo cambiará aún más. Al medir los cambios relativos en el ángulo de la SPR, interacciones como estos pueden ser monitoreadas en tiempo real.

Otra técnica llamada localizada, o " L " SPR, utiliza nanopartículas de metal como la superficie del sensor. Las propiedades que afectan el ángulo SPR son muy localizadas a cada nanopartícula, que mejora la resolución de la señal y sensibilidad.

SPR

al investigar las interacciones de enlace con el estándar, el sensor se monta generalmente en una plataforma que se convierte en el piso de una celda de flujo en el instrumento. Las biomoléculas de interés llevan a través de la célula de flujo tampón. La superficie del sensor está cubierta a menudo primero con un sustrato que tiene una alta afinidad por el metal. Esto asegura que una cantidad significativa de ligando, que a su vez se une al analito de interés, se inmovilizó sobre el sensor y reduce la probabilidad de que el ligando se disocia durante el procedimiento.

Una vez ligando inmovilizado en el sensor, el analito es fluyó sobre el sensor en buffer. Monitorizando el cambio en el ángulo de la SPR con el tiempo como el analito se une al ligando, se pueden calcular la tasa de enlace y otra información cinética.

Los datos de reflectancia pueden también ser utilizados para imágenes de SPR, o SPRi, por dirigir la luz reflejada a un detector CCD. Esto produce una imagen de alto contraste, alta resolución de la superficie del sensor entero. Con SPR y las técnicas relacionadas, pueden responder a preguntas sobre afinidad molecular, cinética, especificidad y concentración de.

Ahora que usted comprende lo que está siendo medida en un experimento SPR, que ' s mira un procedimiento para investigar los tipos de enlace.

antes de comenzar los buffers del procedimiento, el funcionamiento y la muestra debe estar preparado. El búfer de ejecución se utiliza para depositar el ligando en el sensor, y el tampón se utiliza para depositar el analito. La viruta del sensor se limpia cuidadosamente y cargada en una vaina. Luego, el dispositivo se coloca en el instrumento, donde se convierte en la parte inferior de la celda de flujo. El software del instrumento está configurado para el experimento y el análisis posterior. Si es necesario, la superficie del sensor está preparada con un sustrato para capturar el ligando. El ligando es fluyó sobre la superficie del sensor en el búfer de ejecución, donde es capturado por el sustrato en la superficie del sensor.

, El analito en el tampón de muestra se ejecuta a través de la célula de flujo, donde se une selectivamente al ligando inmovilizado. El cambio en reflectividad es trazado y con respecto a los controles para determinar constantes de velocidad y otros datos de cinética de reacción para la reacción investigada.

ahora que entiendes cómo se realiza un experimento SPR, ' s, mira en algunas otras aplicaciones de la SPR en bioquímica.

Aquí, proyección de imagen de SPR se utilizó para evaluar las proteínas con una gran variedad de receptores de la once en un sensor 3D gráficos de reflexión frente al tiempo y concentración del receptor se prepararon de los datos de reflectividad para cada proteína. Estos " perfiles " son característicos para cada proteína y así podría ser utilizado posteriormente para la identificación de proteínas.

En este experimento, las secreciones de la célula fueron estudiadas usando un sensor LSPR por encargo. El sensor también era compatible con SPRi y fluorescencia microscopía. Al depositar la célula en el sensor, se podía medir la interacción de las secreciones de la célula con la matriz de nanopartículas con alta resolución espacial.

Aquí, se investigó el uso de puntos cuánticos, semiconductores a nanoescala, como un agente de mejora de señal SPR mezclado con el analito. Esto realzó " nano-SPRi " método fue comparado con ensayos por SPRi estándar y el método de ELISA. El método de nano-SPRi mejoró significativamente la sensibilidad y límite de detección mientras que todavía siendo menos desperdiciador de tiempo que el método de ELISA.

te ' ve a Miró JoVE ' s video en resonancia de plasmón superficial. Este fenómeno se utiliza para el monitor y la imagen las interacciones biomoleculares sin el uso de etiquetas. Este video introdujo los principios de la SPR, un protocolo típico para llevar a cabo un experimento SPR y unas cuantas aplicaciones de SPR en bioquímica.

Gracias por ver!

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la bioquímica. Resonancia de plasmón superficial (SPR). JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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