Surface Plasmon Resonance (SPR)

Biochemistry

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Summary

Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) ist das zugrunde liegende optische Phänomen hinter markierungsfreie Biosensoren, die molekulare Affinität, Kinetik, Spezifität und Konzentration von Biomolekülen zu bewerten. In SPR auftreten biomolekulare Wechselwirkungen auf eines Biosensors gemacht der eine dünne Metallschicht auf ein Prisma. Echtzeit-Interaktionen von Biomolekülen lässt sich durch Messung der Veränderungen des Lichts reflektiert die Unterseite der Metal

Dieses Video beschreibt die grundlegenden Konzepte der SPR und wie ist es zur Analyse und Visualisierung von biomolekularen Wechselwirkungen. Es folgt eine Probenvorbereitung und experimentelles Protokoll für die Untersuchung von verbindlichen Tarife mit Spr Im Anwendungsabschnitt, SPR Bildgebung, lokalisierte SPR und Quantenpunkt werden erforscht, verbesserte SPR.

Surface Plasmon Resonanz oder SPR, ist das zugrunde liegende Phänomen hinter bestimmten markierungsfreie Biosensoren für die Bewertung der Bindung und Adsorption Interaktionen von Biomolekülen. Bindung-Assays, die erfordern, Kennzeichnung, wie ELISA, können ein zeitaufwändiger Prozess sein und können die Funktionalität des Analyten verändern. In SPR auftreten biomolekulare Wechselwirkungen auf einen speziellen Sensor gemacht aus einer dünnen Schicht aus Metall auf der einen Seite eines Prismas. Durch die Überwachung der Veränderungen des Lichts reflektiert Weg von der Unterseite des Metalls, SPR Instrumente visualisieren diese Interaktionen in Echtzeit, ohne den Einsatz von Etiketten. Dieses Video führt die Grundsätze der SPR, ein allgemeines Verfahren für die SPR Bildgebung und einige Anwendungen in der Biochemie.

an SPR Sensor ist in der Regel aus einer dünnen Schicht von Edelmetall auf das Gesicht eines Prismas. Um die Messwerte des Sensors zu nehmen, wird Licht aus der Prisma-Metall-Schnittstelle in einem Photodetektor reflektiert. Das reflektierte Licht haben einen hohe Intensität außer in einem bestimmten Winkel, im Zusammenhang mit der elektronischen Eigenschaften der Metalloberfläche, bekannt als die " Oberflächen Plasmon Resonanz Winkel ".

Wie Moleküle an der Oberfläche zu binden, ändern die elektronischen Eigenschaften des Metalls, das passt wiederum des Winkels. Als neue Proteine zu befestigen, verschiebt bilden komplexe, die Winkel weiter. Durch Messung der relative Veränderungen in der SPR-Winkel, wie diese Interaktionen können in Echtzeit überwacht werden.

Eine andere Technik namens lokalisierte, oder " L " SPR, Metall-Nanopartikeln als die Sensorfläche verwendet. Die Eigenschaften, die den SPR-Winkel zu beeinflussen sind stark lokalisiert zu jeder Nanopartikel, die Sensibilität und Signal Auflösung verbessert.

Bei der Untersuchung von bindender Wechselwirkungen mit Standard SPR, der Sensor ist in der Regel in einer Plattform montiert, die der Boden eine Messzelle im Instrument wird. Die Biomoleküle von Interesse sind durch die Durchflusszelle von Pufferlösung durchgeführt. Die Sensorfläche ist oft zunächst mit einem Substrat beschichtet, die eine hohe Affinität für das Metall hat. Dadurch wird sichergestellt, dass eine erhebliche Menge an Liganden, die wiederum mit den Analyten von Interesse verbindet, auf den Sensor immobilisiert werden wird und verringert die Wahrscheinlichkeit, die während des Verfahrens die Liganden distanzieren wird.

Einmal der Ligand immobilisiert auf dem Sensor ist, der Analyten fließt über den Sensor im Puffer. Durch die Überwachung der Änderung in der SPR-Winkel im Laufe der Zeit wie der Analyten an den Liganden bindet, die Bindung und andere kinetische Informationen berechnet werden können.

Die Reflexion Daten können auch verwendet werden für SPR Bildgebung oder SPRi, durch das reflektierte Licht auf einer CCD-Detektor zu lenken. Dadurch entsteht ein kontrastreiches, hochauflösendes Bild der gesamte Sensorfläche. Mit SPR und die damit verbundenen Techniken, Fragen über molekulare Affinität, Kinetik, Spezifität und Konzentration beantwortet werden können.

Nun, dass Sie verstehen, was wird gemessen in einem Experiment SPR, lassen Sie ' s Blick auf ein Verfahren zur Untersuchung von verbindlichen Preise.

vor Beginn der Prozedur, den Betrieb und die Probe Puffer bereit sein muss. Die laufenden Puffer wird verwendet, um die Liganden auf den Sensor zu hinterlegen und dem Probenpuffer wird verwendet, um den Analyten zu hinterlegen. Der Sensor-Chip ist sorgfältig gereinigt und in einer Hülle geladen. Dann befindet sich das Gerät in das Gerät, wo wird es am Ende der Messzelle. Die Gerätesoftware wird für das Experiment und die anschließende Analyse eingerichtet. Bei Bedarf wird die Sensorfläche mit einem Substrat, die Liganden erfassen grundiert. Die Liganden ist floss über die Sensorfläche im laufenden Puffer, wo sie durch das Substrat auf die Sensoroberfläche erfasst.

Ist der Analyt in der Probenpuffer durch die Durchflusszelle führen dann wo es selektiv an der immobilisierten Liganden bindet. Die Reflexion ist geplottet und gegenüber Kontrollen Geschwindigkeitskonstanten und andere Reaktionskinetik-Daten für die untersuchten Reaktion bestimmen.

nun, dass Sie verstehen, wie ein SPR-Experiment durchgeführt wird, lassen Sie ' s Blick auf einigen andere Anwendungen in der Biochemie SPR.

Hier, SPR Bildgebung wurde verwendet, um Proteine mit einer Reihe von elf Rezeptoren auf einen Sensor. 3D Grafiken der Reflektivität im Vergleich zur Zeit bewerten und Rezeptor Konzentration aus den Daten der Reflektivität für jedes Protein vorbereitet wurden. Diese " Profile " sind charakteristisch für jedes Protein, und könnte somit nachträglich für Proteinidentifizierung eingesetzt werden.

In diesem Experiment wurden Zelle Sekret untersucht, mit einem maßgeschneiderten LSPR Sensor. Der Sensor war auch kompatibel mit SPRi und Fluoreszenz-Mikroskopie. Nach Hinterlegung der Zelle auf dem Sensor, die Interaktion der Zelle Sekrete mit der Nanopartikel-Array mit hoher räumlicher Auflösung gemessen werden kann.

Hier, die Nutzung der Quantenpunkte, nanoskaligen Halbleitern als SPR Signal Erweiterung Agent gemischt mit den Analyten untersucht wurde. Dies verbessert " Nano-SPRi " Methode war im Vergleich zu Proben von standard SPRi und der ELISA-Methode. Die Nano-SPRi-Methode verbessert die Empfindlichkeit und die Nachweisgrenze und trotzdem weniger zeitaufwändig als der ELISA-Methode.

Sie ' Ve beobachtete, wie Jupiter ' s-video auf Oberflächenplasmonenresonanz. Dieses Phänomen wird zum Monitor und Bild biomolekularer Wechselwirkungen ohne den Einsatz von Etiketten verwendet. Dieses Video eingeführt, die Grundsätze der SPR, ein typisches Protokoll für die Durchführung ein SPR-Experiment und ein paar Anwendungen von SPR in Biochemie.

Vielen Dank für das Ansehen von!

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Grundlagen der Biochemie. Surface Plasmon Resonance (SPR). JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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