Culture de tissus de Histotypic

Bioengineering

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Summary

Bien vitroplants à deux dimensions a été commune pendant un certain temps, les cellules se comportent de façon plus réaliste dans une culture en trois dimensions et plus imite étroitement les tissus natifs. Cette vidéo présente la culture de tissus histotypic, où la croissance et la propagation d’une lignée de cellules se fait dans une matrice tridimensionnelle ingénierie pour atteindre haute densité cellulaire. Ici, nous montrons la récolte des cellules provenant de tissus de donneurs, suivi par culture cellulaire sur une construction machinée.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Bio-ingénierie. Culture de tissus de Histotypic. JoVE, Cambridge, MA, (2018).

Histotypic culture de tissus permet aux cellules d’être cultivées en trois dimensions, en créant in vitro des morphologies de tissu qui imitent la fonction tissu réaliste, qui peut être utilisée comme constructions viables pour la réparation tissulaire. Ces cultures sont généralement des structures tridimensionnelles composées de cellules du même type cultivé à haute densité. Les trois dimensions structure, également connus comme l’échafaud, imite la matrice extracellulaire naturelle. Selon le type de cellule utilisé, échafaudages peuvent être conçus pour une application spécifique et généralement agissent comme modèle pour des tissus bio-mimétique. Cette vidéo va présenter les principes fondamentaux des cultures de tissus histotypic, une procédure d’isolement de cellules, et la fabrication et la cellularisation d’un tissu de soie poreux d’échafaudage pour imiter le tissu cardiaque.

Tous les tissus sont constitués de deux éléments fondamentaux, la matrice extracellulaire et les cellules de tissu-spécifique qui l’habitent. La matrice extracellulaire est un réseau de protéines structurales qui créent un trois environnement tridimensionnel pour cellules à occuper, et les cellules qu’il contient sont censés récapituler les processus physiologiques natives du tissu. Actuellement, une technique courante utilisée pour les tissus de modèle est deux dimensions culture de tissus, où les cellules sont dispensés sur un substrat plat et autorisés à former une couche mince. En général, cette méthode n’est pas fiable pour le maintien d’un phénotype in vivo, les fonctions de certains organes et cellule à cellule ou cellule d’interactions contextuelles de substrat. Culture de tissus Histotypic soulage ces limitations en fournissant un échafaudage 3D pour les cellules à se développer, résultant en un réseau dense de cellules qui plus étroitement imite morphologies cellulaires natives et facilite le développement de réseaux intercellulaires réalistes et voies de communication. Une variété de réseaux de polymères 3D, y compris les tapis de soie hydrogels et électrofilées, offrent des moyens pratiques pour cellules de culture tissulaire spécifique en trois dimensions. Afin de remplir ces échafaudages, les cellules doivent être isolées. Les cellules primaires utilisés dans cette vidéo sont récoltées dans des tissus vivants, ce qui sont frit et ensuite digéré dans une solution d’enzyme pour séparer les cellules cibles de la matrice extracellulaire. Une fois que les cellules sont isolées, il y a deux techniques utilisées pour amorcer les échafaudages. La technique de gouttelettes implique pipetage une solution des cellules sur l’échafaud à une vitesse lente et constante. La deuxième, ou la technique de suspension cellulaire, submerge l’échafaud dans une suspension cellulaire. Souvent, l’échafaudage et la suspension sont secouées pour encourager la migration cellulaire dans la matrice. Les deux techniques créent bioingénierie à haute densité. Les procédures suivantes impliquera l’isolement des cellules cardiaques et la technique de suspension de cellules à créer un échafaudage spécifique des cellules cardiaque, qu’il conservera la morphologie tissulaire de cœur natif.

Pour commencer le processus permettant d’isoler les cellules provenant de tissus de donneurs, commencez en veillant à ce que les instruments de travail zone et dissection sont stérilisés. Ensuite, placez un drap stérile sur la surface de travail dans le cabinet de bio-sécurité. Placer les instruments chirurgicaux stériles sur le drap sans y toucher et puis ouvrez une lame de bistouri stérile numéro 20. Après euthanasier le spécimen, stériliser la zone chirurgicale avec une compresse imbibée de Bétadine. Lorsque vous êtes prêt, sécuriser l’échantillon et commencer l’approche chirurgicale pour isoler le tissu d’intérêt. Dans ce cas, il sera le coeur. Une fois excisées, placer le tissu sur la glace dans la boîte de Pétri contenant du glucose de PBS. Enlever les résidus de sang ou du tissu conjonctif et ensuite transférer le tissu à une boîte de Pétri avec du glucose de PBS frais. Puis, à l’aide de micro-ciseaux stériles et forceps, mâcher soigneusement les échantillons de tissus en morceaux d’environ 1 millimètre cube. À l’aide d’une pipette, transférer les morceaux et la mémoire tampon dans un tube conique. Ensuite, retirez tout sauf 10 millilitres de tampon. Ajouter 7 millilitres de solution de collagènase et puis agiter le mélange à 37 ° c pendant 7 minutes. Puis, Pipetez doucement 10 fois pour séparer les morceaux de tissu. Laisser les morceaux à régler, puis aspirer le liquide et jetez-le. Ensuite, répétez la digestion et déposer délicatement la solution pour séparer les morceaux de tissu. Après que les pièces sont sont installés, retirer le surnageant et ramasser dans un tube conique séparé 50 millilitre. Puis, ajouter 10 millilitres de solution d’arrêt dans chaque tube conique contenant le surnageant pour arrêter la digestion.

Maintenant que les cellules primaires ont été isolés, nous allons fabriquer un échafaudage de tissu soie poreux. Pour commencer, versez 30 millilitres de la solution de soie dans un moule. Ensuite, disperser uniformément le 60 grammes de chlorure de sodium tamisé sur la solution. Ensuite, laissez la soie à polymériser sans agitation à température ambiante pendant 48 heures. Ensuite, placez le moule dans un four de 60 degrés pendant 1 heure à finaliser la réticulation et évaporer tout liquide restant. Une fois polymérisé, plonger le moule dans un bécher d’eau distillée pendant 48 heures à coller comme une sangsue sur le sel. Ensuite, retirez le moule de l’échafaud et découper des petits disques avec une biopsie de 5 millimètres punch. Couper les disques jusqu'à une hauteur de 2 millimètres et enfin, enlever les centres de chaque pièce avec un poinçon de biopsie de 2 millimètres de créer un cercle. Enfin, autoclave les échafaudages dans un cycle humide pendant 20 minutes.

Avec l’échafaud préparé, commençons la cellule ensemencement des processus. Tout d’abord, placez un échafaudage stérile / puits dans une plaque 96 puits. Ajoutez ensuite, le milieu de culture cellulaire pour immerger les échafaudages et incuber à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire pour équilibrer leur pendant au moins 30 minutes. Après incubation, aspirer l’excès du milieu et puis ajoutez la suspension de cellules isolées de primaire pour les échafaudages. Ensuite, remettez la plaque dans l’incubateur et le laisser une nuit pour les cellules à fixer sur les échafaudages. Le lendemain matin, aspirer les cellules non inscrits avec précaution et remplacer par 200 microlitres de milieu de culture de cellules fraîches / puits. L’échafaud qui en résulte est une construction poreuse avec une densité cellulaire élevée prête à être utilisé.

Maintenant que vous avez appris comment effectuer les vitroplants histotypic, regardons quelques applications pratiques de ces matériaux. Histotypic culture de tissus peut créer des micro-environnements cellulaires qui imitent les tissus natifs et sont ainsi en mesure de fournir un modèle adéquat pour l’étude du comportement cellulaire concernant un type de cellule unique. Par exemple, fibre 3D dans les échafaudages, qui avec plus de précision, imiter la niche de cellules souches trouvée in vivo, peut être ensemencée avec des cellules souches pluripotentes à dépister les indices biologiques et de déterminer leurs effets sur la différenciation des cellules souches. Ce travail peut finalement fournir une meilleure compréhension de comment les cellules souches se différencient et peuvent offrir un aperçu favorisant la différenciation cellulaire et la régénération pour applications d’ingénierie tissulaire. Comme cultures dynamiques, climatisation mécanique peut également améliorer l’échafaud de tissu 3D en la soumettant à des charges mécaniques divers auxquels peuvent être confrontés en vivo naturelle des tissus. En appliquant la compression et charges biaxiales pendant la croissance des cellules, la morphologie des cellules et la matrice extracellulaire est modifiée pour tenir compte de ces contraintes mécaniques. Il en résulte un échafaudage préconditionnés bioingénierie tissulaire avec une structure cellulaire qui ressemble à tissu natif, ce qui est idéal pour l’implantation dans des domaines auxquels peuvent être confrontés les forces mécaniques similaires. Enfin, constructions de l’ingénierie tissulaire peuvent également servir à remplacer ou réparer les défauts de tissu. Pour y parvenir, l’échafaud de tissu doit être d’abord vascularisé, permettant ainsi au sang se déplacer librement à travers la construction. Une fois que vascularisé, l’échafaudage peut être transféré et implanté dans le défaut de tissu pour lancer la réparation. Greffe réussie peut être confirmée plus tard par le biais de l’histologie, qui révèle si oui ou non le tissu construire complètement réparé la zone endommagée.

Vous avez juste regardé introduction de Jove pour culture de tissus histotypic. Vous devez maintenant comprendre comment de simples 3D structures sont préparés, comment les cellules primaires sont isolées et ensemencées sur un échafaudage et les différentes applications de ces cultures dans le domaine de la bio-ingénierie. Merci de regarder.

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